一种敞开式快速培养含油微生物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种敞开式培养含油微生物的方法，具体地说涉 及一种敞开式半混合培养含油微藻和含油酵母来获取高含油微生物细胞收获量，同时提高 含油微生物细胞油脂含量的方法。
【背景技术】
[0002] 目前世界各国面临石油资源枯竭、CO2排放引发的一系列气候问题和环境污染问 题，开发可再生的清洁能源称为研究热点。以微生物油脂等可再生资源为来源的生物柴油 具有能量密度高、含硫量低、燃烧充分、润滑性好等性能，还具有可再生、环境友好、易生物 降解、储运安全、抗爆性能好等特点，可作为石化能源的替代品。
[0003] 文献表明，少数微生物可在一定条件下将胞内碳水化合物、碳氢化合物和普通油 脂等转化并贮存超过细胞干重20%的油脂，具有该表型的微生物称为含油微生物，已知细 菌、酵母、霉菌、藻类中都有生产油脂的微生物。微生物油脂又称单细胞油脂，其脂肪酸组成 与一般的植物油脂相似，以C16、C18系脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸等饱和与 不饱和的脂肪酸为主。微生物发酵利用底物范围较广，可直接利用葡萄糖、果糖、蔗糖、糖 蜜、淀粉和纤维素水解液等，不但可以提供新的油脂生产方法，而且可以利用廉价废弃生物 质，降低油脂生产成本，保护环境。因此，微生物油脂是潜在的动植物油脂替代资源，具有广 阔的应用前景。
[0004] 微生物油脂的制备一般采用产油酵母为发酵菌种，经过常规的微生物培养进行生 物量积累，得到含油微生物菌体，进而处理该菌体，得到微生物油脂。CN200610113582. X公 开了一种利用微生物发酵油脂制备生物柴油的方法，即以酵母菌为微生物产油脂菌种，通 过在产油脂菌种培养基中接入该酵母菌微生物，在一定的培养条件下进行微生物发酵制备 油脂，然后经离心、分离、提取得到微生物发酵油脂，以该微生物油脂为原料，在催化剂作用 下进行转酯化反应，得到生物柴油，副产物为甘油。该技术过程采用单一微生物发酵培养过 程，其生物油脂积累在细胞内，细胞收获量是制约油脂收获量的关键因素。
[0005] 除了含油酵母外，微藻是另外一类含油微生物，微藻富含不饱和脂肪酸、淀粉(如 小球藻和莱茵衣藻等）和蛋白质等营养成分(如螺旋藻等)，可用作能源、医药和食品等领域 原料；通过条件调控，微藻细胞可以大量积累脂肪酸，有些微藻如小球藻，其体内脂肪酸含 量可占细胞干重的30%?60%。利用培养微藻来积累油脂资源，已经成为目前利用太阳能和 固定二氧化碳开发可再生资源最热门的研究领域，不仅具有巨大的市场潜力，而且具有突 出的社会价值。
[0006] 微藻细胞的生长方式一般为光自养和碳源异养两种，光自养过程要消耗CO2, CO2 的有效利用吸收，是实现理想培养效果的关键，同时存在补充CO2与光合作用产生O2的解 吸、排出的问题。CN200410020978. 0和CN03128138. 9均采用在光生物反应器系统中加入一 种装置方法，来实现CO2的补给，同时也能实现一定的氧的解析效果。碳源异养过程是利用 有机碳源为底物替代自养过程中的CO 2来进行微藻生物质的积累，细胞生长速度较快，但细 胞内油脂积累水平却比较低下。
[0007] 现有技术虽然对含油酵母和含油微藻的培养都有所涉及，但都是各自进行单独 培养，对于不同类型的含油微生物之间的混合协同培养方式来实现高效油脂收获等方面 的研究较少。在培养过程中普遍存在着成本高、微生物细胞累积慢、油脂含量低等不足。 CN200910237936. 5公开了一种混合培养酵母和藻类生产油脂的方法，该方法利用工业废水 为培养基，混合培养酵母和藻类，生产微生物油脂。但是，由于酵母和藻类的混合培养均是 异养培养，细胞内油脂积累水平较低；并且两种细胞一起收获和提取油脂，由于油脂提取的 方法不同，破壁要求不同，混在一块效果不佳。
【发明内容】
[0008] 针对现有技术的不足，本发明提供一种敞开式快速培养含油微生物的方法。本发 明方法利用膜分离装置将含油微藻与含油酵母在敞开式光生物反应器中进行半混合培养， 具有提高含油微生物细胞收获量，提高无机碳源（CO 2)的利用率，简化培养装置，提高微生 物油脂含量，提高产品总油脂量等优点。
[0009] 本发明敞开式快速培养含油微生物的方法，包括如下内容： (1) 培养含油酵母种子液； (2) 培养含油微藻种子液； (3) 将含油酵母种子液和含油微藻种子液接入内部铺设膜分离装置的敞开式光生物反 应器内进行半混合培养，膜分离装置将光生物反应器分成上下两个区域，含油酵母在膜分 离装置下部区域进行培养，含油微藻在膜分离装置上部区域进行光合作用生长，上下区域 的培养基组成和培养条件一致，培养过程中补充含油酵母生长代谢所需的有机碳源；所述 光生物反应器上部区域的内壁和膜分离装置的上端布设有反光膜。
[0010] 本发明中，膜分离装置可采用各种具有膜分离功能的膜装置，优选采用陶瓷膜分 离装置，膜孔直径为〇. 05 μ m?0. 5 μ m，将含油酵母细胞与含油微藻细胞分隔开来。
[0011] 本发明中，膜分离装置将光生物反应器分成上下两个区域的体积比为1:1?5:1。
[0012] 本发明中，所述的敞开式光生物反应器还包括布气装置，铺设在反应器下部区域 的底部，分布的气体可以经过膜分离装置进入整个光生物反应器中。
[0013] 本发明中，光生物反应器上部区域的内壁部分或全部覆盖反光膜。
[0014] 本发明中，膜分离装置的上端布设的反光膜通过支撑板与膜分离装置之间实现通 气，每平方米反光膜上分布200?300个小孔，孔直径1?10 mm。
[0015] 本发明中，外置光源的光线射入光生物反应器到达反应器内壁后经反光膜实现反 光，光线折返可以实现双光程或多光程状态，光生物反应器内光源得到加强。反光膜优选采 用3M反光膜，3M反光膜是一种玻璃珠封入式反光膜，背面涂有压敏胶和易剥离背纸，即使 在完全湿润状态下或者在大角度下，也可以保持它良好的反光性能。
[0016] 本发明中，含油酵母包括酿酒酵母(5： cererisiae)、粘红酵母(TP. 状丝抱酵母隐球酵母WAitZw1S)等，有机碳源为 葡萄糖、果糖、淀粉、纤维素水解液等。含油酵母种子液培养是本领域技术人员熟知的方法， 如采用搅拌式生物反应器，加入培养基和含油酵母，在适宜的条件下进行培养。
[0017] 本发明中，含油微藻包括小球藻、葡萄藻、小环藻、硅藻等，藻种种子液培养是本领 域技术人员熟知的方法，如采用常规的气升式光生物反应器进行种子液培养。
[0018] 本发明中，敞开式半混合培养过程中，含油酵母种子液与含油微藻种子液的初始 接入体积比为1:1?1:10。半混合培养的初始培养基采用含油酵母所需的培养基，同时添 加含油微藻生长所需的无机盐和微量元素(如按SE培养基的组成添加相关物质）等。敞开 式半混合培养过程中，以批次或连续等方式补充含油酵母生长过程所需有机碳源。
[0019] 本发明中，半混合培养条件一般采用与含油酵母生长过程的条件相似的条件，如 温度一般为20°c?37°C，pH值一般为6. 0?9. 0,优选为6. 5?7. 5等。
[0020] 本发明将含油酵母和含油微藻进行半混合培养，含油酵母与含油微藻生长条件和 所需碳源不同，互相补充和促进。含油微藻利用含油酵母发酵后废弃碳源（CO 2)为自身生长 碳源，同时维持系统较平稳的渗透压条件（pH值)，通过补充有机碳源保证含油酵母不断生 长。同时，光生物反应器内壁和膜分离装置上端均具有反光膜，使外置光源实现返程，增加 光合作用强度。通过光合作用且在反光膜作用下培养体系处在双光程或多光程环境下使微 藻快速生长。
[0021] 本发明通过膜分离装置隔离开含油酵母与含油微藻，实现各自单独的生长空间。 培养基组成则是实现共混与互通，从而实现含油酵母与含油微藻在敞开式光生物反应器中 的半混合培养。微藻对发酵过程使用的碳源具有耐受性，不影响微藻的生长和油脂的积累， 并对含油酵母的发酵过程不存在影响，可以同时获得所需的含油酵母细胞，从而实现含油 酵母与含油微藻的半混合培养过程。
[0022] 本发明选择适宜种类的含油酵母和适宜种类的含油微藻，通过控制含油酵母和 含油微藻的培养过程，使两者形成稳定的半混合培养体系，并建立起不同细胞间共同利用 环境营养条件而细胞间不互相干扰的生长关系，实现了含油酵母和含油微藻的高效生长过 程，提高了油脂的累积效果，并提高了单一微生物培养过程中单位发酵体系内的油脂收获 量，从而为微生物油脂的制备奠定了基础。并且，由于油脂提取的方法不同，破壁要求不同， 两种细胞分别收获和提取油脂，效果更佳。
【附图说明】
[0023] 图1是本发明一种具体工艺流程示意图； 其中：1-含油酵母种子，2-含油微藻种子，3-含油酵母种子液培养反应器，4-