含油微 藻种子液培养反应器，5-含油酵母种子液接种管线，6-微藻种子液接种管线，7-膜分离 装置，8-敞开式光生物反应器，9-混合培养基及酸碱中和剂进入管线，10-含油微藻生长 区，11-含油酵母生长区，12-光生物反应器内壁的反光膜，13-膜分离装置上端的反光膜； 14-布气装置，15-尾气出口。
【具体实施方式】
[0024] 本发明敞开式培养含油微生物的方法，具体包括如下内容：半混合培养之前，两种 含油微生物分别单独进行种子液培养，采用搅拌式生物反应器进行含油酵母种子液培养， 采用光生物反应器进行含油微藻种子液培养，搅拌式生物反应器内包括含油酵母和含油酵 母发酵培养基，光生物反应器内包括含油微藻和含油微藻培养基。种子液培养达到对数生 长期后，含油酵母经管线接种到内部铺设膜分离装置的敞开式光生物反应器的下部区域， 含油微藻经管线接种到该光生物反应器的上部区域，光生物反应器内壁和膜分离装置上端 均具有反光膜，使外置光源实现返程，增加光照强度，进一步提高光合效率。通过光合作用 且在反光膜作用下培养体系处在双光程或多光程环境下，提高微藻光合效率，进一步提高 微藻生长速率和油含量。混合培养基营养成分经无菌处理后加入反应器中，酸碱中和剂经 无菌处理后用来控制半混合培养生长所需的PH环境，其中混合培养基中的有机碳源用于 含油酵母生长，而含油酵母生长所产生的CO 2给含油微藻提供生长所需的碳源。含油酵母种 子液与含油微藻种子液接种体积比例为1:1?1:10。接种后半混合培养体系通过正常PH 控制、温度控制和通气量等控制培养过程。其中半混合培养时有机碳源优选采用流加方式 进行，其被含油酵母利用生长，含油酵母生长后产生较多的CO 2，排出细胞外进入培养系统 中。由于含油酵母排出的CO2处于溶解状态，因此可以立即通过膜孔隙传递到敞开式光生 物反应器的上部区域被培养基系统中的自养微藻利用，作为微藻细胞生长的碳源供应。
[0025] 下面通过附图进一步说明本发明的详细工艺过程。如图1所示，含油酵母种子1 经含油酵母种子液培养反应器3培养生长达生物量OD值为5. 0?15. 0 ;微藻种子2经微 藻种子液培养反应器4培养生长达生物量OD值为2. 0?10. 0。将培养好的含油酵母种子 液由接种管线5转接到内部铺设膜分离装置7的敞开式光生物反应器8的下部区域，即含 油酵母生长区11 ;将微藻种子液由接种管线6转接到该光生物反应器8的上部区域，即含 油微藻生长区10进行半混合培养；并将混合培养基及酸碱中和剂9加入光生物反应器中进 行混合，同时经过检测分析混合后培养系统中pH值来调节混合培养液的pH至6. 5?7. 5。 同时光生物反应器内壁的反光膜12和膜分离装置上端的反光膜13均具有反光作用，使外 置光源实现返程，增加光照强度，进一步提高光合效率。气体由布气装置14进入反应体系 内，通过气体经含油酵母生长区11到达微藻生长区10,从而实现向含油酵母和敞开式光生 物反应器内供气的需要，通入的气体统一由尾气出口 15排出整个反应体系。
[0026] 本发明中，含油酵母在有机碳源条件下实现快速生长，含油酵母消耗有机碳源，生 成细胞生物质和各种代谢产物，细胞生物质由于体形较大而被膜截留在光生物反应器的下 部区域，同时发酵产生CO 2气体排出细胞外后经过膜孔隙传递到敞开式光生物反应器的上 部区域，使培养体系内CO2含量增加，微藻通过光合作用将CO 2和水转化为和O2大分子有机 物，如油脂。同时，含油酵母发酵使系统的PH值下降，而随着微藻的生长，利用溶解的C0 2， 使系统的PH值上升，两者互为作用，调节系统的pH处于适宜范围。
[0027] 本发明中，光生物反应器可以是板式、管式、气升搅拌式等敞开式反应器，可以通 入的氮气或含二氧化碳气体。光生物反应器的其它操作条件按常规的酵母和微藻培养条件 控制。可以设置培养体系二氧化碳和溶解氧量的测定装置，根据需要调整通气量，以获得良 好的效果。同时提供PH电极检测，以便通过外源加入酸、碱来实现系统pH的控制。
[0028] 本发明中，？!1控制酸中和剂为!1(：1、4504、圆03等常用的无机酸，碱中和剂为似0!1、 NaHC03、KOH、Ca (OH) 2、氨水等常用的无机碱。
[0029] 本发明中，半混合培养过程温度控制为内部盘管加热方式。
[0030] 本发明中，向铺设膜分离装置的光生物反应器的下部区域和上部区域内可以通入 氮气或含二氧化碳的气体，气体通过下部区域后由膜空隙进入上部区域，进而引出整个反 应器；通入气体量随敞开式半混合培养的培养液体积变化而变化，通入气体体积速率与培 养系统装液体积比例为〇. Ivvm?I. Ovvm (单位液体体积每分钟通入的单位气体量)。
[0031] 本发明中，光生物反应器内培养基为含油酵母和含油微藻所需的混合培养基，可 以提供含油酵母生长所需营养物质，也提供自养微藻光合生长所需营养成份，两种细胞通 过膜分离装置被分隔开来，实现各自单独的生长空间，减弱不同细胞间生态影响，同时也为 各自细胞的收获提供了方便。含油酵母利用其适宜的培养基(其中碳源为有机碳源)进行生 长，获得生物量的增长，部分有机碳源通过发酵过程呼吸生成CO 2，这部分CO2在培养体系中 作为微藻进行光合作用的碳源，微藻经光合作用将CO2和水转化为O 2和大分子有机会，如碳 水化合物和油脂。
[0032] 本发明中，含油酵母所需的有机碳源可以是葡萄糖、果糖、淀粉水解液和纤维素水 解液等，该有机碳源的加入采用流加补充方式进行，根据培养液样品成份分析，随时检测系 统的有机碳源浓度水平，将配制好的有机碳源母液按消耗速度进行流加。
[0033] 本发明中，半混合培养过程培养基的初始有机碳源浓度（以有机物质量浓度计，下 同）为1. 0%?5. 0%，培养过程中通过含油酵母生长消耗，有机碳源经过补加泵进行不断补 力口，维持有机碳源浓度在1. 〇%?2. 0%。
[0034] 本发明中，含油酵母种子液的培养基采用其适用的含油酵母培养基，自养微藻种 子液的培养基采用微藻SE培养基。半混合培养过程采用含油酵母培养基和微藻SE培养基 相结合，包括有机碳源、无机盐和微量元素等成份，成为混合培养基。优选的培养条件为： 种子液接种量（占光生物反应器体积）=5%?20%，温度：25 °C?30 °C，通气量：0. I vvm? I. 0 vvm，揽拌转速：100 rpm ?400 rpm，时间：24 h ?120 h。
[0035] 方案1 (比较例） 将粘红酵母(中国微生物菌种保藏中心提供)在300 mL摇瓶中进行培养，所用培养基为 粘红酵母PDA培养基，培养20 h后得到所需种子液，OD值为12. 0左右。将培养的粘红酵 母种子液接入本发明方法提到的内部铺设的陶瓷膜分离装置的20 L敞开式光生物反应器 的下部区域，膜孔直径为0. 1 μ m，光生物反应器上下两个区域的体积比为1:1。光生物反应 器底部铺设布气装置，可以实现培养液的返混；光生物反应器为玻璃体，反应器内有温度控 制盘管，以及pH、O 2和CO2传感器。
[0036] PDA培养基配方（以每升计）： 葡萄糖20.0 g，马铃薯液1000 mL，pH自然。其中马铃薯营养液的制作：将200 g马铃 薯切成小块后煮沸20?40分钟，多层纱布过滤，定容至1000 mL。
[0037] SE培养基配方（以每升计）： NaNO3 0. 20 g, K2HPO4 · 3H20 0. 07 g, MgSO4 · 7H20 0. 07 g, CaCl2 · 2H20 0. 03 g, KH2PO4 0.18 g，NaCl 0.03 g ,FeCl3 ·6Η20 0.01 g，Fe-EDTA I mL ,Soil extract (土壤提取液） 40 mL〇
[0038] 培养条件为，采用混合培养基（以PDA培养基为基础，同时按SE培养基组成添加适 宜物质):接种量（占光生物反应器体积，下同）为10%，温度为30 °C，通气量(氮气)0.4 vvm， 搅拌转速为200 rpm，时间为120 h，pH为7. 0。
[0039] 培养5天后终止培养，收集含油酵母细胞，分析其干重与油脂含量，得出单位发酵 体系含油微生物油脂的收获量。
[0040] 方案2 (比较例） 将小球藻(购自中科院水生所藻种库1#)在摇瓶中进行光自养培养，所用培养基为SE 培养基，培养2天后得到所需种子液，OD值为8. O左右。按10%的接种量将培养好的小球藻 种子液接种至20 L敞开式光生物反应器中，培养基为SE培养基。光生物反应器为气升搅 拌式，可以实现培养液的返混；反应器为玻璃体，设置日光灯源，自动控制设定光的开关时 间，形成小球藻培养过程中光暗过程转换。反应器内有温度控制盘管，以及pH、O 2和CO2传 感器。培养条件同比较例方案1，通气采用空气压缩机压缩氮气通入，通气量0.4 vvm。藻 种为普通小球藻，小球藻培