mm的5个滤纸孔，平放于直径为90mm的培养皿中，加适量蒸馏水将所述滤纸浸湿，在温度121 °C、压力120kPa条件下保持灭菌20分钟后，取出滤纸。
[0040]在100ml水中加入15g琼脂粉、8g葡萄糖、8g淀粉、4g羧甲基纤维素钠、8g蛋白胨、3g硫酸镁、3g磷酸二氢钾、4g硫酸亚铁和75mg维生素B1，搅拌均匀，配制成琼胶培养基，将配制好的琼胶培养基在温度121°C、压力120kPa条件下灭菌，然后加入到灭菌后的培养皿中，每培养皿加入量为18ml，待琼胶培养基凝固后制成琼胶培养平板。
[0041]用无菌镊子将所述经过灭菌的滤纸平铺在琼胶培养平板表面上，使所述滤纸与所述琼胶培养平板之间无空隙，无气泡。
[0042]然后用无菌针挑取适量未产孢丝孢真菌菌种，接种于所述滤纸上的各个滤纸孔中心位置的改良琼胶培养平板上。
[0043]盖上培养皿盖，用封口膜密封，然后于室温、自然光线下培养，第10天开始滤纸表面开始产生分孢子，培养10?30天，滤纸上形成密集的分生孢子。
[0044]根据真菌的生长周期，在培养第10天、第15天、第20天和第30天于体视镜下观察滤纸表面产生的分生孢子及产孢表型。
[0045]实施例3
[0046]取直径为70_的圆形滤纸，在所述滤纸上均匀剪出直径为12_的6个滤纸孔，平放于直径为90mm的培养皿中，加适量蒸馏水将所述滤纸浸湿，在温度121 °C、压力120kPa条件下保持灭菌20分钟后，取出滤纸。
[0047]在100ml水中加入18g琼脂粉、6g葡萄糖、6g淀粉、4g羧甲基纤维素钠、7g蛋白胨、4g硫酸镁、4g磷酸二氢钾、3g硫酸亚铁和70mg维生素B1，搅拌均匀，配制成琼胶培养基，将配制好的琼胶培养基在温度121°C、压力120kPa条件下灭菌，然后加入到灭菌后的培养皿中，每培养皿加入量为16ml，待琼胶培养基凝固后制成琼胶培养平板。
[0048]用无菌镊子将所述经过灭菌的滤纸平铺在琼胶培养平板表面上，使所述滤纸与所述琼胶培养平板之间无空隙，无气泡。
[0049]然后用无菌针挑取未产孢丝孢真菌菌种，按照每孔直径5mm的菌饼的接种量接种于所述滤纸上的各个滤纸孔中心位置的改良琼胶培养平板上。
[0050]盖上培养皿盖，用封口膜密封，然后于室温、自然光线下培养，第10天开始滤纸表面开始产生分孢子，培养10?20天，滤纸上形成密集的分生孢子。
[0051]对比实验例
[0052]以一株分离自人工盐池的丝孢真菌(菌株编号为YC1407)为例，培养条件为:
[0053]实验例按照实施例2的培养条件进行培养，对比例与之不同的是，使用的培养基为PDA培养基，而非本发明的改良琼胶培养基。
[0054]对比例:丝孢真菌YC1407在PDA培养基上培养产生大量菌丝。如附图图1所示，分别在培养第10天、15天、20天观察菌落形态，可见培养基表面产生大量菌丝，菌丝灰白色，呈絮状。在体视镜下观察产孢情况(附图2)，虽然经过长时间培养但未见产孢结构及分生孢子产生，仅可见灰白色细丝状菌丝。
[0055]实验例:利用本发明实施例2的培养方法进行丝孢真菌YC1407培养，经过20天连续培养，分别在第10天、15天、20天观察菌落形态，其菌落形态如附图3所示。由图3可见，菌株YC1407在改良琼胶培养基表面的菌丝厚度明显小于其在PDA培养基上产生的菌丝厚度，随着培养时间延长，其菌落颜色逐渐加深。将上述培养菌落在体视镜下观察(如附图4所不)，菌株YC1407在培养第10天时，滤纸表面开始形成产孢结构和分生孢子，随着培养时间延长，滤纸表面形成的典型产孢结构及分生孢子逐渐增加，培养第20天时可见在滤纸表面密集产生大量分生孢子。
[0056]利用本实验例培养方法，进行菌株YC1407产孢表型的连续观察(如附图5所示)。菌株YC1407培养第10天，在体视镜下可见已分化产生分生孢子梗，并开始产生分生孢子；培养第15天观察，可见其分生孢子梗端部产生的分生孢子呈链状排列，孢子链较短，可形成具有分枝的分生孢子链；培养第20天观察，可见较长的分生孢子链并且孢子链分枝明显O
[0057]对比试验结论:
[0058]利用本发明方法，能成功的快速诱导菌株YC1407产生大量典型的产孢结构和分生孢子，并可根据实验需要同时进行不同时期的产孢表型观察。通过制作菌体玻片观察其产孢结构和分生孢子特征，结合产孢表型特点，经查阅文献资料，鉴定菌株YC1407为Alternaria alternata，属半知菌门，丝抱纲(Hyphomycetes)，丝抱目(Hyphomycetales)，暗色孢科（Dematiaceae) 。
【主权项】
1.一种诱导丝孢真菌产孢的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)取圆形滤纸，在所述滤纸上均匀剪出4个以上的滤纸孔，平放于培养皿中，加蒸馏水将所述滤纸浸湿，进行高温高压灭菌后，取出滤纸； (2)配制琼胶培养基，将配制好的琼胶培养基灭菌，加入到灭菌后的培养皿中，每培养皿加入量为15?20ml，待琼胶培养基凝固后制成琼胶培养平板； (3)将所述经过灭菌的滤纸平铺在琼胶培养平板表面上，使所述滤纸与所述琼胶培养平板之间无空隙，无气泡； (4)然后挑取适量未产孢丝孢真菌菌种，接种于所述滤纸上的各个滤纸孔中心位置的改良琼胶培养平板上； (5)盖上培养皿盖密封，然后于室温、自然光线下培养10?30天，滤纸上密集产生大量的分生孢子。
2.如权利要求1所述的一种诱导丝孢真菌产孢的方法，其特征在于所述琼胶培养基的制备方法为:在100ml水中加入10?20g琼脂粉、5?1g葡萄糖、5?1g淀粉、3?5g羧甲基纤维素钠、5?1g蛋白胨、2?5g硫酸镁、2?5g磷酸二氢钾、2?5g硫酸亚铁和50?80mg维生素B1，搅拌均勾。
3.如权利要求1所述的一种诱导丝孢真菌产孢的方法，其特征在于:步骤(I)中，在所述滤纸上均匀剪出4?6个滤纸孔。
4.如权利要求2所述的一种诱导丝孢真菌产孢的方法，其特征在于:所述滤纸直径为65?75mm，所述滤纸孔的直径为12?18_。
5.如权利要求1所述的一种诱导丝孢真菌产孢的方法，其特征在于:步骤(4)中，所述未产孢丝孢真菌菌种的接种量为每孔接种直径2?5mm菌饼。
6.如权利要求1至5任一权利要求所述的一种诱导丝孢真菌产孢的方法，其特征在于:所述的高温高压灭菌是在温度121°C、压力120kPa条件下保持灭菌20分钟。
【专利摘要】本发明公开了一种诱导丝孢真菌产孢的方法，包括以下步骤：(1)取圆形滤纸，均匀剪出4个以上的滤纸孔，平放于培养皿中，加适量蒸馏水浸湿，高温高压灭菌后取出滤纸。(2)配制琼胶培养基并灭菌，然后加入到灭菌后的培养皿中，每培养皿加入量为15～20ml，待琼胶培养基凝固后制成琼胶培养平板。(3)将经过灭菌的滤纸平铺在琼胶培养平板表面上。(4)挑取适量未产孢丝孢真菌菌种，接种于各个滤纸孔中心位置的改良琼胶培养平板上。(5)盖上培养皿盖密封，于室温、自然光线下培养10～30天。本发明方法操作简单，培养条件温和，诱导丝孢真菌产孢效果显著，对多数丝孢真菌有效，分生孢子在滤纸上分布均匀，便于观察产孢表型。
【IPC分类】C12N3-00
【公开号】CN104745522
【申请号】CN201510212162
【发明人】潘好芹, 夏海波, 赵静, 李艳青
【申请人】潍坊科技学院
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年4月29日