面结合附图对本发明作更进一步的说明。
[0037] 一种两核苷酸不同步合成测序分析PCR产物单体型方法，步骤包括：1)DNA提取； 2)PCR扩增；3)测序：每次测序反应同时加入两个不同的核苷酸，且PCR扩增产物中不同 DNA模板的合成测序不同步，使得相邻两个SNP位点上不同的测序信息是由不同测序反应 所提供；4)关联分析：根据这些不同步合成测序反应所得到的不同SNP位点上的测序信息 进行关联分析，确定PCR产物单体型。
[0038] 不同步合成是指PCR产物中包含的不同DNA模板在相邻两个SNP位点的测序信息 是通过不同的合成测序反应获得的。单个测序反应获得的测序信息包括两核苷酸种类的信 息和测序信号强度信息，所述测序信号强度与合成核苷酸数目成正比。根据不同步合成测 序反应所得到的不同SNP位点上的测序信息进行关联分析，构建关联方程式，确定PCR产物 单体型及含量；
[0039] 关联方程式为：对于包含任意相邻两个SNP位点的PCR产物，不超过四种不同的 DNA模板；设定这四种单体型1、…、i的含量分别为Xl、…、Xi，其中2彡i彡4，且七+…… +Xi= 1 ;则PCR产物中混合DNA模板单个测序反应测序信号强度f n、fn'与Xl、…、Xi存在 下列关系：（f n-fn'）= …xi;其中n表示第n次测序反应；f n、fn'分别表示第n 次测序反应的测序信号强度与背景值；a:n、…、分别表示100%单体型DNA序列1、…、 i在第n次测序反应中合成的核苷酸数目。
[0040] 比如设定四种单体型1、2、3、4的含量分别为Xp x2、x3、x4, Xi+xfxfxf 1 ;贝PCR 产物中混合DNA模板测序反应测序信号强度fn、fn'与4、1 2、13、14存在下列关系：^-4'） -a nXi+an x2+an x3+a n x4〇
[0041] 实施例 1 :人样本包含 MMP7(U25346)基因 A/G(rsll568818)和 C/T(rsll568819) 核酸片段的PCR产物的单体型分析
[0042] 以 MMP7(U25346)基因包含 A/G(rsll568818)和 C/T(rsll568819)两个 SNP 位点 的PCR产物制备的单链DNA模板为例，来说明不同步合成测序关联分析对单体型样本的检 测。
[0043] A)从文献或者数据库中可以查出在下列四种理论存在的单体型中，"大样本"只存 在单体型1、2、3,而不存在单体型4(下划线字母为SNP位点）。
[0044] 单体型 1 如 5' -SEQ ID NO :4 所示：
[0045] 5? -ACGAATACATTGTGTGCTTCCTGCCAATAAC
[0046] 单体型 2 如 5' -SEQ ID NO :5 所示：
[0047] 5? -ACGAATACATTGTGTGCTTCCTGCCAATAA1
[0048] 单体型 3 如 5' -SEQ ID NO :6 所示：
[0049] 5? -ACAAATACATTGTGTGCTTCCTGCCAATAAC
[0050] 单体型 4 如 5' -SEQ ID NO :7 所示：
[0051] 5? -ACAAATACATTGTGTGCTTCCTGCCAATAAT
[0052] B)按照（A+TV(C+G)循环两核苷酸焦测序时，单体型1、2、3按照（A+TV(C+G)循 环两核苷酸合成测序分别得到的编码信息与每个测序反应的合成核苷酸数目a mn(m = 1~ 4)如表1所示。
[0053] C)假定单体型1、2、3的含量分别为XpX2、x3，且Xi+x 2+x3= 1 ;贝PCR产物中混合 DNA模板测序反应峰强度与Xi、x2、x3有下列关系：（f n_fn'）=a1nx1+a2n x2+a3n x3。从表1 可以看出，能够构建独立方程的反应包括第1、2、14、15、16个测序反应，但应注意第2、14个 测序反应不能同时使用，它们对于单体型1和3而言不是相对独立的。如选取：
[0054] (f2_f2'）= Xi+3x2+x3;
[0055] (fi6_fi6, ) = 2x1+x2+x3；
[0056] 且 1 = Xi+xfXy
[0057] 那么可以求出：
[0058] Xj= (f 16-f16, )-1 ;
[0059] x2= [(f 2-f2, )-l]/2 ；
[0060] x3= 5/2-(f 16-f16, )-(f2-f2, )/2 ；
[0061] 从而确定实际样本的单体型及其含量（需要考虑实验误差）。
[0062] 表1.三种单体型按照（A+TV(C+G)循环在每个测序反应中的系数
【主权项】
1. 一种两核苷酸不同步合成测序分析PCR产物单体型方法，其特征在于：步骤包括：1) DNA提取；2)PCR扩增；3)测序；4)关联分析； 所述步骤3)的测序方法为：同时加入两个不同的核苷酸，PCR扩增产物中不同DNA模 板的合成测序不同步，得到相邻两个SNP位点上不同步的测序信息。
2. 根据权利要求1所述的两核苷酸不同步合成测序分析PCR产物单体型方法，其特征 在于：所述步骤3)的具体方法包括以下步骤： 3-1)制备单链DNA模板：将PCR扩增产物与亲和素修饰的磁珠反应，修饰生物素的DNA链固定到所述磁珠上，在〇. 2MNaOH溶液下变性；将未固定的另一条DNA链清除；然后用洗 液洗涤，得到固定的单链DNA模板； 3-2)测序引物杂交：将测序引物与所述单链DNA模板在杂交反应体系中，80°C下放置 5min，自然冷却至室温，完成杂交； 3-3)焦测序：配备焦测序反应体系，与所述步骤3-2)得到的杂交产物混合，按照循环 加入两核苷酸方式对DNA模板进行循环焦测序反应，得到由按照先后顺序排列的单个测序 反应的碱基片段编码信息。
3. 根据权利要求2所述的两核苷酸不同步合成测序分析PCR产物单体型方法，其特征 在于：步骤3-2)中，所述测序引物是一段与单链DNA模板完全互补的一段序列；所述测序 引物为 5'-SEQIDN0:l_3' 所不：5'-ctaaaacgaggaagtattacatc_3' ； 所述杂交反应体系的条件为：IOmMTris-HCl，2MNaCl，ImMEDTA，0. 1 %Tween20,pH 7. 6〇
4. 根据权利要求2所述的两核苷酸不同步合成测序分析PCR产物单体型方法，其特征 在于：步骤3-3)中，焦测序反应体系包括pH7. 7的0?IMTris-Ac，2mMEDTA，10mMMg(Ac)2, 0. 2%BSA, 10mMDTT,IOmMAPS,0. 4mg/mLPVP,4mMD-luciferin, 2U/mLATPsulfurylase, 0. 4mMluciferase，2U/mLapyraseVII，2U/mLDNA聚合酶I0
5. 根据权利要求2所述的两核苷酸不同步合成测序分析PCR产物单体型方法，其特征 在于：所述循环加入两核苷酸方式包括（A+GV(C+T)，（A+CV(G+T)，（A+TV(C+G)三组中的 一组或一组以上的循环测序方式；两核苷酸加入的顺序按照循环的方式，或按照以四种不 同的两核苷酸为原料，每次加入一种两核苷酸来实施。
6. 根据权利要求1所述的两核苷酸不同步合成测序分析PCR产物单体型方法，其特征 在于：所述步骤3)中，每个测序反应获得的测序信息包括两核苷酸种类信息和测序信号强 度信息，所述测序信号强度与合成核苷酸数目成正比； 所述步骤4)中，根据不同步合成测序反应所得到的相邻两个SNP位点上的测序信息进 行关联分析，构建关联方程式，确定PCR产物单体型及含量； 所述关联方程式为：对于包含任意相邻两个SNP位点的PCR产物，不超过四种不同的DNA模板；设定这四种单体型1、…、i的含量分别为X1、…、Xi，其中2彡i彡4,且X1+…… +Xi= 1 ;则PCR产物中混合DNA模板单个测序反应测序信号强度fn、fn'与X1、…、Xi存在 下列关系：（fn-fn'）=S1nX1+…+S1nXi;其中n表示第n次测序反应；fn、fn'分别表示第n次 测序反应的测序信号强度与背景值；B1n、…、Bin分别表示100%单体型DNA序列1、…、i 在第n次测序反应中合成的核苷酸数目。
7. 根据权利要求6所述的两核苷酸不同步合成测序分析PCR产物单体型方法，其特征 在于：所述SNP位点上的测序信息进行关联分析是指两个相邻SNP位点均是杂合型的单个 样本的关联分析； 若PCR产物中包含若干个SNP位点的分析，将其分解成相邻两个SNP位点的单体型关 联分析。
8. 根据权利要求1所述的两核苷酸不同步合成测序分析PCR产物单体型方法，其特征 在于：所述步骤2)中，扩增条件为：94°C起始变性5min;35个热循环为：94°C变性30s、61°C 退火45s、72°C延伸45s;最后72°C延伸7min; PCR扩增所用的PCR-条引物为5'端被生物素、氨基或者丙烯酰胺基团修饰，与表面修 饰亲合素、羧基的固相载体反应，或者与丙烯酰胺单体聚合反应制备单链DNA模板，包括： 5'-SEQIDNO:2_3' 所不：5'-agtctacagaactttgaaagtatgtg-3' ； 5? -biotin-SEQIDNO:3-37 所不：5J -biotin-ctatgagagcagtcatttgactttg-3? 〇
9. 根据权利要求1所述的两核苷酸不同步合成测序分析PCR产物单体型方法，其特征 在于：所述核苷酸dNTPs合成实时合成释放的检测分子是相同的，所述检测分子为化学发 光检测的焦磷酸盐、电化学检测的氢离子或者光学检测的荧光信号。
10. 根据权利要求1所述的两核苷酸不同步合成测序分析PCR产物单体型方法，其特征 在于：所述PCR扩增产物的分析指包括单个样本PCR产物和混合样本PCR产物的分析。
【专利摘要】本发明公开了一种两核苷酸不同步合成测序分析PCR产物单体型的方法。通过两核苷酸实时合成测序，每个测序反应同时代加入两个不同的核苷酸，且PCR产物中不同DNA模板的合成测序不同步，使得相邻两个SNP位点上不同碱基的信息是由不同测序反应所提供。根据这些不同步合成测序反应所得到的不同SNP位点上的测序信息进行关联分析，确定PCR产物单体型。本发明拓广了分析范围，操作简单、可以降低分析成本；适合多个混合样本的单体型分析，可以直接测定混合样本中各个单体型的比例，可以用于从大规模样本中寻找、筛选核酸标志物。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104762406
【申请号】CN201510198271
【发明人】肖鹏峰, 潘荣芳
【申请人】东南大学
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年4月23日