EQ ID NO: 1至30的序列，且分析了 在转化的成纤维（NIH3T3)细胞内的双调蛋白的表达模式，也就是，siRNAS抑制双调蛋白的 表达的程度。
[0316]2-1 :成纤维细朐株的培养
[0317] 将从美国典型培养物保藏中心（ATCC)得到的小鼠成纤维细胞株（NIH3T3)于37°C 和 5% (v/v)C02条件下置于 RPMI-1640 培养基（GIBCO/Invitrogen，美国，10% (v/v)胎牛 血清，100单位/_青霉素和100U g/时链霉素）中培养。
[0318]2-2 :目标siRNA向成纤维化细朐株的转染
[0319] 将实施例2-1培养的1 X 105成纤维细胞置于12孔培养板内的RPMI1640 (GIBC0， 美国）中在37°C和5% (v/v)C02条件下培养18小时，然后除去培养基，之后把500 #的 Opti-MHM培养基分配到每一个孔内。
[0320]同时，将2叫脂质体 Lipofectamine? 2〇00 (Invitrogen,美国）与248|1必 Opti-Mffl培养基的混合物在室温下反应5分钟，向230# Opti-Mffl培养基内加 入20#实施例1制备的含有具有任--条SEQIDN0:1至30的序列的有义链的 siRNA(lpm〇le/(i€)来制备最终浓度为20nM的siRNA溶液。所述脂质体Lipofectamine 2000混合物和每一种siRNA溶液混合，在室温下培育20分钟来制备转染液。
[0321] 下一步，将500M上述每一种转染液分别分配到每一个含有肿瘤细胞株和 Opti-MEM的孔内并培育6小时，然后除去Opti-MEM培养基。然后将1 RPMI 1640培养 基分配到每一个孔中，并在37°C和5% (v/v)C02条件下培育24小时。
[0322]2-3 :对双调蛋白mRNA的宙量分析
[0323] 从实施例2-2的转染细胞株中提取出总RNA，并用它合成其cDNA，用实时PCR对双 调蛋白mRNA的表达水平进行相对定量。
[0324]2-3-1 :从转染细朐中分离RNA以及cDNA的合成
[0325]利用 RNA 提取试剂盒（AccuPrep Cell total RNA extraction kit, BI0NEER， 韩国）从经实施例2-2转染的细胞株中提取出总RNA，并利用RNA反转录酶（AccuPower CycleScript RT Premix/dT20，Bioneer,韩国）用以下方式合成为cDNA。特别地，向 0.25Eppendorf 管中的AccuPower CycleScript RT Premix/dT20(Bioneer,韩国）里 加入1 y g/管的所提取的RNA，并添加经DEPC (焦碳酸二乙酯）处理过的蒸馏水至总体积 20 然后，利用基因扩增系统（MyGenie? 96 Gradient Thermal Block, BI0NEER，韩国） 将上述RNA和引物在30°C条件下杂交一分钟，保持温度52°C 4分钟即合成cDNA。杂交和 cDNA合成的过程重复6次，然后保持温度95°C 5分钟使酶失活，从而扩增cDNA。
[0326]2-3-2 :双调蛋白mRNA的相对宙量分析
[0327] 以实施例2-3-1合成的cDNA作为模板，利用实时PCR以以下方式对双调蛋白mRNA 的相对水平进行定量。特别地，用蒸馏水将实施例2-3-1合成的cDNA稀释五倍，为了分析 双调蛋白mRNA的表达水平，向96孔板的每一个孔中加入3 |Ji上述稀释过的cDNA，1〇辦 2XGreenStar? PCR master mix(BI0NEER，韩国），6# 蒸馏水和1 # 双调蛋白 qPCR引物 (每种引物10pmole/XBI0NEER，韩国）来制备混合物。同时，GAPDH(甘油醛-3-磷酸 脱氢酶），一种持家基因（后文中表示为HK基因），作为标准基因用来归一化双调蛋白mRNA 的表达水平。利用 Exicycler? 96 Real-time Quantitative Thermal Block(BI0NEER，韩 国）将上述含有混合物的96孔板进行以下反应。特别地，将上述混合物在95°C条件下反 应15分钟，激活酶并除去cDNA的第二结构，然后混合物进行42个循环的反应，每一个循 环包括变性94°C 30s，退火58°C 30s，延伸72°C 30s，SYBR green扫描以及最后72°C条件 下3分钟的延伸。接下来，混合物在55°C保持1分钟，分析55°C~95°C的溶解曲线。PCR 扩增完后，通过计算经GAPDH基因归一化的mRNA值（归一化因数，NF)来校正双调蛋白的 Ct (循环阈值）值，然后利用一个未经siRNA处理的对照值来计算ACt值。用ACt值和公 式2 (_Aet) X 100 (见图1)对因双调蛋白特异性-siRNA引起的双调蛋白mRNA的表达水平进 行相对定量，上述双调蛋白特异性-siRNA含有具有SEQ ID NO: 1至30各一序列的有义链。
[0328] 为了选出高效能的siRNAs，挑出了 15种不同的siRNAs，所述siRNAs分别包含一 条有义链，该有义链具有SEQ ID NO: 2, 6至9, 11，17至21，23, 24, 28和29各一序列，这些 最终浓度为20nM的siRNAs显示出经其处理过后双调蛋白mRNA的表达水平相比于空白对 照组有70%或者更高的下降。
[0329]实施例3:被诜用的siRNAs对成纤维（NIH3T3)细朐株中双调蛋白的表汰的抑制
[0330] 用所述双调蛋白特异性-siRNAs(选自实施例2)转化小鼠成纤维（NIH3T3)细胞 株，所述双调蛋白特异性-siRNAs分别包含一条有义链，该有义链具有SEQ ID N0:2, 6至 9, 11，17至21，23, 24, 28和29各一序列，分析了经改变后的成纤维（NIH3T3)细胞中的双调 蛋白mRNA的表达模式。
[0331]3-1:成纤维细朐株的培养
[0332] 将从美国典型培养物保藏中心（ATCC)得到的小鼠成纤维细胞株（NIH3T3)于37°C 和 5% (v/v)C02 条件下置于 RPMI-1640 培养基（GIBCO/Invitrogen，美国，10% (v/v)胎牛 血清，100单位/_青霉素和1〇〇 u g/_链霉素）培养。
[0333]3-2:目标siRNA到成纤维细朐株的转染
[0334] 将实施例2-1培养的1 X 105成纤维细胞置于12孔培养板内的RPMI1640 (GIBC0， 美国）中在37°C和5% (v/v)C02条件下培养18小时，然后除去培养基，之后将500 #的 Opti-MHM培养基分配到每一个孔内。
[0335]同时，使 2 脂质体 Lipofectamine? 2〇00 (Invitrogen,美国）与 248(I必 Opti-Mffl培养基的混合物在室温下反应5分钟，向245 培养基内加入5叫选 自实施例2的含有具有SEQ ID N0:2, 6至9, 11，17至21，23, 24, 28和29各一序列的有义链 的siRNA(l pm〇le/|Ji)来制备最终浓度为20nM的siRNA溶液。上述脂质体Lipofectamine 2000混合物和每一种siRNA溶液混合，在室温下培育20分钟来制备转染液。
[0336] 下一步，将500 #上述每一种转染液分别分散到每一个含有肿瘤细胞株和 Opti-MEM的孔内并培育6小时，然后除去Opti-MEM培养基。然后将1 I^RPMI 1640培养 基分散到每一个孔，并在37°C和5% (v/v)C02条件下培育24小时。
[0337]3-3:双调蛋白mRNA的宙量分析
[0338] 从实施例3-2的转染细胞株中提取出总RNA，并用它合成cDNA，用实时PCR对双调 蛋白mRNA的表达水平进行相对定量。
[0339]3-3-1:从转染细胞中分离RNA以及cDNA的合成
[0340] 利用RNA提取试剂盒（AccuPrep细胞总RNA提取试剂盒，BIONEER，韩国）从经实 施例2-2转染的细胞株中提取出总RNA，并利用RNA反转录酶（AccuPower CycleScript RT Premix/dT20，Bioneer,韩国）用以下方式合成cDNA。特别地，向0.25 M￡ Eppendorf管中 的 AccuPower CycleScript RT Premix/dT20(Bioneer, Korea)里加入 lug/管的上述 RNA， 并添加经DEPC(焦碳酸二乙酯）处理过的蒸馏水至总体积20 然后，利用基因扩增系 统（MyGenie? 96 Gradient Thermal Block, BI0NEER，韩国）将上述 RNA 和引物在 30°C条 件下杂交一分钟，保持温度52°C 4分钟即合成cDNA。杂交和cDNA合成的过程重复6次，然 后保持温度95°C 5分钟使酶失活，从而扩增cDNA。
[0341] 3-3-2 :双调蛋白mRNA的相对宙量分析
[0342] 以实施例3-3-1合成的cDNA作为模板，利用实时PCR以以下方式对双调蛋白mRNA 的相对水平进行定量。特别地，用蒸馏水将实施例3-3-1合成的cDNA稀释五倍，为了分析 双调蛋白mRNA的表达水平，向96孔板的每一个孔中加入3 |Ji上述稀释过的cDNA，丨〇 # 2XGreenStar? PCR master mix(BI0NEER，韩国），6批蒸馈水和1辦双调蛋白qPCR引物 (每种引物10 pmole/辦，BI0NEER，韩国）来制备混合物。同时，GAPDH(甘油醛-3-磷酸 脱氢酶），一种持家基因（后文中用HK基因指代），作为标准基因用来归一化双调蛋白mRNA 的表达水平。利用 Exicycler? 96 Real-time Quantitative Thermal Block(BI0NEER，韩 国）将上述含有混合物的96孔板进行以下反应。特别地，将上述混合物在95°C条件下反应 15分钟，激活酶并除去cDNA的第二结构，然后混合物进行42个循环的反应，每一个循环包 括变性94°C 30s，退火58°C 30s，延伸72°C 30s，SYBR绿扫描以及随后的72°C条件下3分钟 的延伸。接下来，混合物在55°C保持1分钟，分析55°C -95°C的溶解曲线。PCR扩增完后， 通过计算经GAPDH基因归一化的mRNA值（归一化因数，NF)来校正双调蛋白的Ct(循环阈 值）值，然后利用未经siRNA处理的对照值来计算ACt值。用ACt值和公式2 (_Aet)X 100 对因双调蛋白特异性-siRNA引起的双调蛋白mRNA的表达水平的变化进行相对定量，上 述双调蛋白特异性-siRNA含有一条有义链，该有义链具有SEQ ID N0:2, 6至9, 11，17至 21，23, 24, 28 和 29 的序列。
[0343] 为了选择高效能的siRNAs，挑出了 3种不同的siRNAs，所述siRNAs分别包含一 条有义链，该有义链具有任--条SEQ ID N0: :8, 9和28的序列，这些最终浓度为20nM的 siRNAs显示出（经其处理过后）双调蛋白mRNA的表达水平相比于空白对照组有70%或者 更高的下降。检查所选siRNAs的IC 5(I值来确定siRNAs的浓度，经该浓度的siRNAs处理后 目标基因的表达被抑制了 50%。
[0344] 实施例4 :被诜用的siRNAs对成纤维（NIH3T3)细朐株中双调蛋白的表汰的抑制
[0345] 用具有实施例3所选的SEQ ID N0:8,9和28的序列的有义链的双调蛋白特异 性-siRNAs转化成纤维细胞（NIH3T3)，为了确定所述siRNAs的IC 5(I值，分析了经转化后的 成纤维（NIH3T3)细胞中的双调蛋白mRNA的表达模式。
[0346] 4-1 :成纤维细朐株的培养
[0347] 将从美国典型培养物保藏中心（ATCC)得到的小鼠成纤维细胞株于37°C和5% (v/v)C02 条件下置于 RPMI-1640 培养基（GIBCO/Invitrogen，美国，10% (v/v)胎牛血 清，100单位/mi青霉素和100 链霉素）中培养。
[0348]4-2 :目标siRNA到成纤维细朐株的转染
[0349] 将实施例2-1培养的1 X 105成纤维细胞置于12孔培养板内的RPMI1640 (GIBC0， 美国）中在37°C和5% (v/v)C02条件下培养18小时，然后除去培养基，之后将500 #的 Opti-MHM培养基分配到每一个孔内。
[0350]同时，使 2 脂质体 Lipofectamine? 2000 (Invitrogen,美国）与248 |1必 Opti-MEM培养基的混合物在室温下反应5分钟，向249. 8, 249和245# Opti-MEM培养基 内加入0. 2,1和5#选自实施例3的含有一具有任--条SEQ ID N0: : 8,9和28的序列的 有义链的siRNA (1 pm〇le/M)来制备最终浓度为0. 2,1和5nM的siRNA溶液。所述脂质体 Lipofectamine2000混合物和每一种siRNA溶液混合，在室温下培育20分钟来制备转染 液。
[0351] 下一步，将500叫上述每一种转染液分别分配到每一个含有肿瘤细胞株和 Opti-MEM的孔内并培育6小时，然后除去Opti-MEM培养基。然后将1 M^RPMI 1640培养 基分配到每一个孔，并在37°C和5% (v/v)C02条件下培育24小时。
[0352]4-3 :双调蛋白mRNA的宙量分析
[0353] 从实施例4-2的转染细胞株中提取总RNA，并用它合成cDNA，用实时PCR对双调蛋 白mRNA的表达水平进行相对定量。
[0354] 4-3-1 :从转染细朐中分离RNA以及cDNA的合成
[0355] 利用RNA提取试剂盒（AccuPr印细胞总RNA提取试剂盒，BI0NEER，韩国）从经实 施例2-2转染的细胞株中提取出总RNA，并利用RNA反转录酶（AccuPower CycleScript RT Premix/dT20，Bioneer,韩国）用以下方式合成cDNA。特别地，向0.25MSEppendorf管中 的 AccuPower CycleScript RT Premix/dT20(Bioneer, Korea)里加入 lug/管的上述 RNA， 并添加经DEPC(焦碳酸二乙酯）处理过的蒸馏水至总体积20 然后，利用基因扩增系统 (MyGenie? 96 Gradient Thermal Block, BI0NEER，韩国）将上述 RNA 和引物在 30°C条件 下杂交一分钟，保持温度52°C 4分钟即合成cDNA。杂交和cDNA合成的过程重复6次，然后 保持温度95°C 5分钟使酶失活，从而扩增cDNA。
[0356] 4-3-2:双调蛋白mRNA的相对宙量分析
[0357] 以实施例4-3-1合成的cDNA作为模板，利用实时PCR以以下方式对双调蛋白mRNA 的相对水平进行定量。特别地，用蒸馏水将实施例4-3-1合成的cDNA稀释五倍，为了分析 双调蛋白mRNA的表达水平，向96孔板的每一个孔中加入3 (Ji上述稀释过的cDNA，10辦 2XGreenStar?PCRmastermix(BI0NEER，韩国），6叫蒸馏水和1辦双调蛋白qPCR引物 (每种引物10pmole/7^, BI0NEER,韩国）来制备混合物。同时，GAPDH(甘油醛-3-磷酸 脱氢酶），一种持家基因（后文中用HK基因指代），作为标准基因用来归一化双调蛋白mRNA