的表达水平。利用 Exicycler? 96 Real-time Quantitative Thermal Block(BI0NEER，韩 国）将上述含有混合物的96孔板进行以下反应。特别地，将上述混合物在95°C条件下反应 15分钟，激活酶并除去cDNA的第二结构，然后混合物进行42个循环的反应，每一个循环包 括变性94°C 30s，退火58°C 30s，延伸72°C 30s，SYBR绿扫描以及随后的72°C条件下3分钟 的延伸。接下来，混合物在55°C保持1分钟，分析55°C -95°C的溶解曲线。PCR扩增完后，通 过计算经GAPDH基因归一化的mRNA值（归一化因数，NF)来校正双调蛋白的Ct (循环阈值） 值，然后利用未经siRNA处理的对照值来计算ACt值。用ACt值和公式2CAet)X100(见 图2)对因双调蛋白特异性-siRNA引起的双调蛋白mRNA的表达水平的变化进行相对定量。
[0358] 因此，发现分别具有SEQ ID NO::8,9和28的序列的有义链的siRNAs，在低浓 度0. 2nM时均显示出使双调蛋白mRNA的表达水平下降50%或者更高的能力，意味着这些 siRNAs展示出抑制双现蛋白的表达的高效能。
[0359] 实施例5 :目标核苷酸序列的设计和siRNA的制各
[0360] 根据人类双调蛋白mRNA的序列（NM_001657)，设计了可结合上siRNA的目标 核苷酸序列（有义链），并制备了包含与目标核苷酸序列互补的反义链的siRNA。特别 地，利用由Bioneer(韩国）开发的基因设计程序（Turbo si-Designer)根据双调蛋白 mRNA序列（NM_001657_Verl)设计了可结合上siRNA的目标核苷酸序列。本发明的双 调蛋白siRNA具有一个双链结构，该双链结构包括一条由19个核苷酸组成的有义链和 一条与有义链序列互补的反义链。此外，制备了 siC0NT(5'-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3' 作为有义链），一种不抑制任何基因的表达的siRNA。特别地，一系列包括解阻断，耦 联，氧化，和加帽的过程通过利用RNA合成剂在结合了核苷酸的固体支持物上反复进行 (384Synthesizer，BIONEER, KOREA)，从而得到包含了具有所期望长度的RNA的反应产物。 利用配备了 Daisogel C18柱子（Daiso，日本）的HPLC918(日本分析工业，日本）将上述 RNA从反应产物中分离纯化出来，并利用MALDI-T0F质谱仪（Shimadzu，日本）对其进行分 析确认它是否与期望的核苷酸序列一致。接下来，RNA的有义链与反义链互相结合，从而制 备包含了各具有SEQ ID NO:31至230的序列的有义链的siRNA，和siCONT。
[0361]实施例6 :siRNA对人类肺癌细朐株内的双调蛋白的表汰的抑制
[0362] 用分别具有SEQ ID NO: 31至230的有义链的各siRNA(实施例1制备的）转化人 类肺癌细胞株（A549)，分析因siRNA的处理而造成的转化细胞内，双调蛋白的表达模式。
[0363] 6_1 :人类肺癌细胞株的培养
[0364] 将从美国典型培养物保藏中心（ATCC)得到的人类肺癌（A549)细胞株于37°C和 5% (v/v)C02 条件下置于 RPMI-1640 培养基（GIBCO/Invitrogen，美国，10% (v/v)胎牛血 清，100单位/ml青霉素和1〇〇 链霉素）中培养。
[0365] 6-2 :目标siRNA到人类肺癌细朐株的转染
[0366] 将实施例6-1培养的1 X 105人类肺癌（A549)细胞置于6孔培养板内的DMEM中 在37°C和5% (v/v)C02条件下培养18小时，然后除去培养基，之后将500#的Opti-MEM 培养基分配到每一个孔内。
[0367]同时，使3.5脂质体Lipofectamine? RNAi Max(Invitrogen,美国）与 246.5#Opti-MEM培养基的混合物在室温下反应5分钟，向230#Opti-MEM培养基内 加入5或20#实施例5制备的含有具有任意一条SEQ ID N0:8,9和28的序列的有义链 的siRNA(lpm〇le/|i《)来制备最终浓度为20nM的siRNA溶液。所述脂质体Lipofectamine max混合物和每一种siRNA溶液混合，在室温下反应15分钟来制备转染液。
[0368] 下一步，将500 上述每一种转染液分别分配到每一个含有肿瘤细胞株和 Opti-MEM的孔内并培育6小时，然后除去Opti-MEM培养基。然后将1 M￡RPMI 1640培养 基分配到每一个孔，并在37°C和5% (v/v)C02条件下培育24小时。
[0369]6-3:双调蛋白mRNA的宙量分析
[0370] 以与实施例2-3-1所述的相同的方式从实施例6-2的转染细胞株中提取出总RNA， 并用它合成cDNA，然后用实时PCR对双调蛋白mRNA的表达水平进行相对定量。
[0371]6-3-1:双调蛋白mRNA的相对宙量分析
[0372] 用从实施例6-2转染的细胞株中以与实施例2-3-1相同的方式制备的cDNA为 模板，利用实时PCR以以下方式对双调蛋白mRNA的相对水平进行定量。特别地，用蒸馏 水将制备的cDNA稀释五倍，为了分析双调蛋白mRNA的表达水平，向96孔板的每一个 孔中加入3上述稀释过的 cDNA，10/^2XGreenStar? PCR master mix(BI0NEER， 韩国），6辦蒸馏水和1辦双调蛋白qPCR引物（hAREG-F,ACACCTACTCTGGGAAGCGT;hAREG-R，GCCAGGTAITTGTGGITCGT;每种引物10pmole/4 , BI0NEER，韩国）来制备混合 物。同时，GAPDH (甘油醛-3-磷酸脱氢酶；hGAPDH-F, GGTGAAGGTCGGAGTCAACG ;hGAPDH-R, AC CATGTAGTTGAGGTCAATGAAGG)，一种持家基因（后文中表示为HK基因），作为标准基因用来归 一化双调蛋白 mRNA 的表达水平。利用 Exicycler? 96 Real-time Quantitative Thermal Block(BI0NEER，韩国）将上述含有混合物的96孔板进行以下反应。特别地，将上述混合物 在95°C条件下反应15分钟，激活酶并除去cDNA的第二结构，然后混合物进行42个循环的 反应，每一个循环包括变性94°C 30s，退火58°C 30s，延伸72°C 30s，SYBR绿扫描以及随后 的72°C条件下3分钟的延伸。接下来，混合物在55°C保持1分钟，分析55°C -95°C的溶解 曲线。PCR扩增完后，通过计算经GAPDH基因归一化的mRNA值（归一化因数，NF)来校正双 调蛋白的Ct(循环阈值）值，然后利用未经siRNA处理的对照值来计算ACt值。用ACt 值和公式2(_ AGt)X100(见图3)对因具有SEQ ID N0:31至50各序列的有义链的双调蛋白 特异性-siRNA引起的双调蛋白mRNA的表达水平的变化进行相对定量。可见几乎所有的双 调蛋白特异性-siRNAs都抑制双调蛋白mRNA的表达，且与对照组相比，在经双调蛋白特异 性-siRNAs处理过的细胞内，双调蛋白mRNA的表达水平下降了很多。在这些双调蛋白特异 性-siRNAs中，包含具有SEQ ID N0:39至41，43至45,47,49和50的序列中任一条的有义 链的siRNA展现了最大的抑制双调蛋白mRNA的表达的能力。
[0373] 此外，发现一可显示出对双调蛋白表达的高效能抑制作用的siRNA，所述siRNA包 含具有SEQID N0:51至230各序列的有义链，所述siRNA类似于包含具有SEQID N0:31 至50各序列的有义链的siRNA。
[0374] 工业应用性
[0375] 如上所述，本发明的双调蛋白特异性_双链寡siRNA能非常有效地抑制双调蛋白 的表达。因此，包含以下成分的组合物能有效地用于预防或质量呼吸道疾病：双调蛋白特异 性-双链寡siRNA，包含了双链寡siRNA的双链寡结构，和/或包含了双链寡结构的纳米颗 粒。
[0376] 虽然已详细地描述了本发明的具体特征，对于本领域内的技术人员来说，显然该 描述仅是对优选地实施方案的描述，而不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围仅受 所附权利要求及其等同物的限制。
[0377] 序列目录Free Text
[0378] 已附上电子文档。
【主权项】
1. 一种双调蛋白特异性-siRNA，包含有义链和反义链，该有义链包含任意一条选自 SEQIDN0:1至SEQIDN0:230的序列，该反义链含有与上述有义链互补的序列。
2. 如权利要求1所述的双调蛋白特异性-siRNA，其中所述siRNA的有义链或反义链由 19-31个核苷酸组成。
3. 如权利要求1所述的双调蛋白特异性-siRNA，其中所述有义链包含任一选自SEQID NO:8, 9, 28, 39至41，43至45, 47, 49和50的序列，所述反义链包含与上述有义链互补的序 列。
4. 如权利要求1至3任一项所述的双调蛋白特异性-siRNA，其中所述siRNA的有义链 或反义链至少包含一种化学修饰。
5. 如权利要求4所述的双调蛋白特异性-siRNA，其中所述化学修饰是选自以下修 饰中的至少一种：一个或多个核苷酸的糖结构的2'碳位置上的0H基团被-CH3(甲 基），-0CH3 (甲氧基），-NH2,-F(氣基），-0-2-甲氧乙基-〇-丙烷基，-0-2-甲硫基，-0-3-丙 氨基，-0-3-二甲基氨丙基，-0-N-甲基乙酰胺或-0-二甲氨基乙氧基取代的修饰；核苷酸 中的糖结构的氧被硫取代的修饰；核苷酸与磷硫酰、硼氢化磷酸盐或甲基膦酸酯键之间的 化学键的修饰；对PNA(核酸肽），LNA(锁核酸）或UNA(未锁核酸）的修饰。
6. 如权利要求1至5任一项所述的双调蛋白特异性-siRNA，其中一个或多个磷酸基团 结合到双调蛋白特异性-siRNA的反义链的5'端。
7. -种双链寡核糖核酸结构，包含由以下结构式（1)所代表的结构： 结构式（1) A-X-R-Y-B 所述结构式（1)中A代表亲水性化合物，B代表疏水性化合物，X和Y各自单独代表简 单的共价键或者连接物-介导的共价键，以及R代表所述双调蛋白特异性-siRNA。
8. 如权利要求7所述的双链寡核糖核苷酸结构，含有由以下结构式（2)所代表的结 构： 结构式（2)
所述结构式（2)中，S和AS分别是双调蛋白特异性-siRNA的有义链和反义链，A，B，X和Y与权利要求7中所定义的相同。
9. 如权利要求8所述的双链寡核糖核苷酸结构，含有由以下结构式（3)所代表的结 构： 结构式（3)
所述结构式（3)中A，B，X，Y，S和AS与权利要求8所定义的相同，5'和3'分别代表双 调蛋白特异性-siRNA的有义链的5'端和3'端。
10. 如权利要求7至9任一项所述的双链寡核糖核苷酸结构，其中所述双调蛋白特异 性-siRNA是权利要求1至权利要求6任一项所述的siRNA。
11. 如权利要求7至10任一项所述的双链寡核糖核苷酸结构，其中所述亲水性化合物 的分子量为200-10, 000。
12. 如权利要求11所述的双链寡核糖核苷酸结构，其中所述亲水性化合物选自聚乙二 醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚恶唑啉中的任何一种。
13. 如权利要求7至10任一项所述的双链寡核糖核苷酸结构，其中所述疏水性化合物 的分子量为250-10, 000。
14. 如权利要求13所述的双链寡核糖核苷酸结构，其中所述疏水性化合物选自类固 醇衍生物，甘油酯衍生物，丙三醇醚，聚丙二醇，(： 12-(：15的非饱和或饱和碳氢物，二酰基卵磷 月旨，脂肪酸，磷脂和脂肪胺。
15. 如权利要求14所述的双链寡核糖核苷酸结构，其中所述类固醇衍生物选自胆固 醇，胆留烷醇，胆酸，胆留醇甲酸酯，胆固醇甲酸盐和胆固醇胺。
16. 如权利要求14所述的双链寡核糖核苷酸结构，其中所述甘油酯衍生物选自单-甘 油酯，双-甘油酯和三-甘油酯。
17. 如权利要求7至16任一项所述的双链寡核糖核苷酸结构，其中X和Y代表的共价 键是可降解的键或者不可降解的键。
18. 如权利要求17所述的双链寡核糖核苷酸结构，其中所述不可降解键是酰胺键或者 憐fe键。
19. 如权利要求17所述的双链寡核糖核苷酸结构，其中所述可降解键是二硫键，可酸 解的键，酯键，酐键，可生物降解的键或可酶解的键。
20. 包含如权利要求7至19所述的双链寡核糖核苷酸结构的纳米颗粒。
21. 如权利要求20所述的纳米颗粒，由包含了具有不同序列的siRNAs的双链寡核糖核 苷酸结构组成。
22. -种药物组合物，含有如权利要求1至6任一项所述的双调蛋白特异性-双链寡 核糖核苷酸，如权利要求7至19任一项所述的双链寡核糖核苷酸结构，或如权利要求20或 21所述的纳米颗粒，作为活性成分。
23. 如权利要求22所述的药物组合物，用于预防或治疗呼吸道疾病。
24. 如权利要求23所述的药物组合物，其中所述呼吸道疾病选自慢性阻塞性肺疾病 (COPD)，特发性肺纤维变性（IPF)，急性/慢性支气管炎，过敏性鼻炎，咳嗽，痰多，支气管 炎，细支气管炎，喉咙痛，扁桃体炎和喉炎。
25. -种包含如权利要求22至24任一项所述的药物组合物的冻干制剂。
26. -种预防或治疗呼吸道疾病的方法，该方法包括给予任何有需要的个体如权利要 求1至6任一项所述的双调蛋白特异性-双链寡核糖核苷酸，如权利要求7至19任一项所 述的双链寡核糖核苷酸结构，如权利要求20或21所述的纳米颗粒，或如权利要求22至25 任一项所述的组合物或制剂。
27. 如权利要求26所述的方法，其中所述呼吸道疾病是选自慢性阻塞性肺疾病 (COPD)，特发性肺纤维变性（IPF)，急性/慢性支气管炎，过敏性鼻炎，咳嗽，痰多，支气管 炎，细支气管炎，喉咙痛，扁桃体炎和喉炎。
【专利摘要】本发明涉及一种能高效地抑制双调蛋白的表达且能有效地用于预防或治疗呼吸道疾病的双调蛋白特异性-双链寡siRNA。此外，本发明还涉及一种双调蛋白特异性-双链寡siRNA结构和由所述寡siRNA结构组成的纳米颗粒，其中双调蛋白特异性-双链寡siRNA结构包含了通过一个简单的共价键或一个由连接物-介导的共价键结合在双调蛋白特异性-双链寡siRNA上的亲水性和疏水性化合物，以便增加双链寡siRNA的体内稳定性和细胞内的传送效能。本发明的双调蛋白特异性-双链寡siRNA结构能够增加双调蛋白特异性-双链寡siRNA的稳定性，不削弱双调蛋白特异性-双链寡siRNA的功能，同时能有效地增加双链寡siRNA的细胞膜渗透性。因此，当利用双调蛋白特异性-双链寡siRNA结构时，即使是在相对低的浓度下被服用的，双调蛋白特异性-双链寡siRNA仍可被有效地传送到细胞内，从而能有效地用于呼吸道疾病的预防或治疗。
【IPC分类】C12N15-113, A61K31-7105
【公开号】CN104781403
【申请号】CN201380058056
【发明人】朴翰浯, 蔡济旭, 尹坪伍
【申请人】株式会社百奥尼
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2013年10月7日
【公告号】CA2887069A1, EP2905337A1, US20150259690, WO2014054927A1