抗空肠弯曲杆菌抗体及其用图
【专利说明】抗空肠弯曲杆菌抗体及其用途 【技术领域】
[0001] 本公开总的涉及抗体，其片段及涉及该蛋白的衍生物和应用。描述的抗体和片段 针对空肠弯曲杆菌（C. jejuni)的鞭毛蛋白。 【【背景技术】】
[0002] 弯曲杆菌属（Campylobacter)包括细菌的大量的形态学上多样的组（螺旋，弯曲 的或杆形状的），报道有超过35个物种和亚种，其中20种被发现对人是病原性的，导致肠和 肠外病，或在人中的多样数的位点定居。（Man，2011)。
[0003]空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni)，革兰氏阴性螺旋细菌，是目前最普遍食 品源的病原体之一，和是人类世界中细菌胃肠炎的主导原因。在北美洲，弯曲菌病数目胜 过由沙门氏菌属（Salmonella)，志贺菌属（Shigella)，利斯特菌属（Listeria)和大肠埃 希氏菌（E. coli)组合的导致的病的报道的情况（Stern&Robach, 2003 ;Newell等人，2003 ; Blaser, 1997)。尽管仅引起相对弱的腹泻病，弯曲杆菌属（Campylobacter)感染与严重的 长期并发症相关，包括：Guillain-Barr6综合征（GBS)，自根除脊髓灰质炎；非-麻痹变体 Miller Fisher 综合征（Humphery 等人? 2007 ;Hariharan 等人? 2004 ;Blaser 等人? 1986); 反应性关节炎（ReA);及炎性肠疾病（IBD) (Rautelin等人.2000 ;Gellynck等人.2008)，是 麻痹的主导原因。
[0004] 估计50~80%之间的人弯曲菌病病例可归因于鸡的食用，由此肉鸡鸡肉被认为 是向人传播病原体的主要载体（EFSA期刊2011 Germans等人.2011)。家禽，及鸡中弯曲杆 菌属（Campylobacter)水平的控制和减小尤其是可改善家禽产物安全性和减小弯曲杆菌 属（Campylobacter)-诱导的胃肠炎的发生率。由此，人中的长期并发症可减少，导致在全 世界节省住院治疗和其他关联的成本中百亿美元（EFSA报道，2011 ;Nyachuba，2010 ;Buzby 等人.1997)。
[0005] 在生产的各阶段，包括在家禽繁殖期间（主要干预），在肉生产期间和/或在 肉处理期间应用针对空肠弯曲杆菌（C. jejuni)及其他欠频繁的株（例如，结肠弯曲 杆菌（C. coli)及红嘴鸥弯曲杆菌（C. lari))的当前干预策略。最接受的策略是通过 安装卫生学屏障和防蝇纱，使用高质量水，减小处死龄及中止的稀疏来防止弯曲杆菌 属（Campylobacter spp.)物种免于进入畜群（Newel l&Wagenaar, 2000 ;Wagenaar 等 人，2006, 2008 ;Lin 2009 ;EFSA报道，2011)。但是，鸡对空肠弯曲杆菌（C. jejuni)感染 的感受性及其环境中到处存在负面地冲击了这些生物安全方法的成功，凸显对可控制或消 除细菌感染的替代性的方法的需求。已就向鸡施用噬菌体作为饲料-添加剂或兽医学药 物报道0. 5~51og1(lCFU/g盲肠弯曲杆菌水平减小（El-Shibiny等人，2009 ;Carrillo等 人，2005 ;Wagenaar 等人，2005)。
[0006] 更有效地，用添加到家禽饮用水的细菌素处理在90%的情况中完全消除病原体或 减少其水平1〇 6倍或更多（Svetoch等人，2010)。其他生物学试剂诸如益生菌（Santini等 人，2010 ;Willis等人，2008)和植物生物活性化合物（Castillo等人，2011 ;Kureckci等 人，2012)也已用作食品或水添加剂及显示显著地减少鸡粪便中弯曲杆菌负荷。针对空肠 弯曲杆菌（C. jejuni)的益生株诸如乳酸细菌（LAB)的杀细菌效应已归因于有机酸，细菌素 或细菌素-样物质的产生（Santini等人，2010;Messaoudi等人，2011)。许多这些方法未 在本领域广泛采用，因为一些问题，诸如功效，安全性，毒性，生产规模和纯化，及弯曲杆菌 抗性的发展。
[0007] 抗生素诸如氟喹诺酮和大环内酯已批准用于处理家禽和人中的弯曲杆菌属 (Campylobacter spp.)物种。但是，人和动物健康中它们的延长的使用导致在全世界许 多国家抗性弯曲杆菌株的快速增加，和它们在动物饲料原料中的使用不再建议（Smith等 人，2010 ;Luangtongkum 等人，2009 ;Alfredson 等人，2007 ;Silva 等人，2011)。中链脂 肪酸（例如，辛酸）和单酰基甘油是抗生素的替代品，及已用作饲料和水添加剂，以控制 或消除鸡中的弯曲杆菌负荷（de los Santos等人，2009 ;Hermans等人，2010，Molatova 等人，2010)。虽然如此，与用化合物处理之后弯曲杆菌属（Campylobacter)的数和流 行相关的数据不一致和对它们的有效性无法作出清楚的结论（EFSA期刊，2011)。抗生 素治疗（包括使用维吉霉素，红霉素，新霉素或环丙沙星，以减少或消除家禽中感染的来 源，或治疗人感染）是有用的工具。但是，关于动物生产中抗生素处理的广泛使用的生长 关心是抗性弯曲杆菌属（Campylobacter)株的发展，及来自鸡的耐抗生素的弯曲杆菌属 (Campylobacter)可在人中导致耐抗生素的感染。
[0008] 针对大量的感染性疾病的疫苗接种在商业上的养殖鸡中广泛使用（Clark等 人，2012)。为抵御弯曲杆菌属（Campylobacter spp.)物种定居的保护的家禽疫苗接种也 已被广泛地研宄。但是，能在短时间（3~4周）引发快速和强免疫应答的交叉-反应性 疫苗祀的鉴定以及对新佐剂的需求是待克服的一些挑战（de Zoete等人，2007;Layton等 人，2011 ;Zeng等人，2010 ;Clark等人，2012)。因而，目前无针对空肠弯曲杆菌（C. jejuni) 的商业疫苗可利用。
[0009] 竞争性排除（CE)方法，由Nurmi和Rantala (1973)首次描述，基于使用来自健康 鸡的肠的定义的或未定义的微生物建立保护性肠菌群，以预防弯曲杆菌占据其特定生态 位，尤其盲肠（Zhang等人，2007 ;Chen，2001 ;Stern，2001)。应用CE方法中的困难包括鉴 定CE产物中的复杂物种的标准化的缺乏，以及减少弯曲杆菌感染中有限的及可变的成功 率（Lin, 2009 ;EFSA 期刊 2011)。
[0010] 最近，已推荐鸡对弯曲杆菌属（Campylobacter spp.)物种的感受性或抗性依赖于 宿主的遗传系统及涉及非-免疫和免疫机理（Kaiser等人，2009)。因此，选择性繁殖会是 选择扩展基因遗传的抗性鸡系的方法。在这点上，在4种近交鸡系之间观察到弯曲杆菌属 (Campylobacter spp.)物种定居中10~100倍数差异，和遗传的抗性模式与单常染色体显 性座位一致（Boyd等人，2005)。但是，抗性鸡系的建立而保持肉或卵生产和质量是具有无 法预测的结果的耗时过程。至今，无上述的实验干预已在领域水平模形化或应用，因此，无 已成功地商业化。
[0011] 抗体最初在1890年代早期由Behring和Kitasato认识为有效抗微生物剂 (Behring&Kitasato, 1890 ;Casadevall等人，2004)，然后，由于血清治疗成为对抗许多感 染性疾病的有效策略。血清或肠分泌中特异性抗体的存在具有相关于兔（Burr等人，1988 ; Pavlovskis 等人，1991 ;Rollwagen 等人，1993)和小鼠（Dolby&Newell 1986 ;Rollwagen 等人，1993)对空肠弯曲杆菌（C. jejuni)定居的抗性。在年轻的鸡（小于2~3周龄） 中，针对弯曲杆菌属（Campylobacter spp.)物种的母源抗体的存在延迟畜群中空肠弯曲杆 菌（C. jejuni)的定居的初现及减小畜群中空肠弯曲杆菌（C. jejuni)的横向传播的速度 (Sahin等人，2003)，提示使用抗-弯曲杆菌属（Campylobacter spp.)物种抗体的被动免疫 治疗可为干扰鸡中细菌定居的有吸引力的方法。的确，用抗-鞭毛单克隆抗体的被动免疫 已显示减少小鼠中空肠弯曲杆菌（C. jejuni)定居（Ueki等人.1987)。类似地，使用超免疫 抗-空肠弯曲杆菌（C. jejuni)兔血清或抗-空肠弯曲杆菌（C. jejuni)抗体呈现在鸡中减 少空肠弯曲杆菌（C. jejuni)定居中有效（Stern等人，1990)。与此一致的是，其他显示了 在血中循环高滴度的弯曲杆菌属（Campylobacter spp.)物种-特异性IgG的家禽屠宰场 工人罕见患弯曲菌病（Cawthraw等人，2000)。尽管观察到全部这些，用于减少弯曲杆菌属 (Campylobacter)负荷的作为药剂的抗体未获得市场大量注意，由于高生产成本，常规抗体 对GI道蛋白酶的敏感性，缺乏有效GI道递送系统，及在弯曲杆菌属（Campylobacter spp.) 物种之中高抗原性变异，这需要革G向弯曲杆菌属（Campylobacter)的不同株的多种抗体制 备物。
[0012] 美国专利No. 8, 173, 130 (Salzman等人），美国专利公开 No. 2009/0208506 (Rachamim 等人），及美国专利公开 No. 2010/0239583 (Murthy 等人）描述 了针对来自各种革兰氏阴性细菌（包括弯曲杆菌属（Campylobacter))的鞭毛蛋白的单克 隆抗体，其可用于制止细菌感染，以及治疗或预防疾病包括炎性肠疾病。这些抗体共享该分 子的常见的缺点，包括加工困难，生产困难和生产成本，及当体内使用时的慢组织穿透。此 外，mAb和其片段（例如，scFv和Fab)对GI道蛋白酶非常敏感，这在期望口服施用时是不 利的。
[0013] 兔和小鼠的血清或肠分泌中特异性抗体的存在已相关于对空肠弯曲杆菌 (C. jejuni)消化道定居的抗性。鸡中的研宄也提示，活性免疫可减小由空肠弯曲杆菌 (C. jejuni)的肠感染水平，但在鸡的早期处死之前获得足够的免疫应答的时间窗，以及成 本和可行性使此方法不切实际。
[0014] 在源头，特别家禽饲养场之内控制弯曲杆菌属（Campylobacter)会减少人暴露于 病原体的风险，和会对食品安全性和公共健康具有显著冲击。有利地，更安全食品供应允许 提供商避免昂贵的操作关闭和产品召回。减少环境暴露，改善生物安全，竞争性排除，疫苗 接种，宿主遗传学选择，及抗微生物或抗生素策略（包括噬菌体治疗和细菌素治疗）是有益 的，但对于减少食品供应中空肠弯曲杆菌（C. jejuni)的改善的策略仍有需求。对由空肠弯 曲杆菌（Campylobacter jejuni)呈现的攻击的创新的方法会对公众有益处。
[0015] 因此，本领域对于减少食品供应中空肠弯曲杆菌（C. jejuni)的成本-有效方法仍 有需求；本领域对于具有高亲和性、但可克服IgG和它们的变体的缺点的抗体也仍有需求。
[0016]【发明概述】
[0017] 本发明总的涉及抗体，其片段及涉及该蛋白的衍生物和应用。描述的抗体和片段 针对空肠弯曲杆菌（c. jejuni)的鞭毛蛋白。
[0018] 分离的或纯化的抗体或其片段如在本文描述，以及其修饰，包括多聚体形式，诸如 五聚抗体。显示抗体或其片段对空肠弯曲杆菌（c. jejuni)鞭毛的亲和性特异性。例如当 经口施用时，抗体显示减少鸡中空肠弯曲杆菌（C. jejuni)定居水平的功效。公开的抗体展 示与细菌鞭毛的特异性结合。本文所述的抗体和多聚体减少空肠弯曲杆菌（C. jejuni)运 动性。还描述具有有利的生物物理学性质的其他变体。通过特定淘选努力和二硫键加工策 略，抗体被描述展示良好热稳定性和蛋白酶耐受性或抗性。也描述超稳定化的抗体或其片 段，对主要胃肠（GI)蛋白酶具有更优热稳定性和抗性。
[0019]由此，本发明提供与空肠弯曲杆菌（C. jejuni)鞭毛特异性结合的分离的或纯化 的抗体或其片段，其包含
[0020] 互补决定区（CDR)l，其包含序列 GLTFRNFHMA(SEQ ID N0:1)或 VSTFSINALG(SEQ ID NO:4)；
[0021] CDR2,其包含序列 ISWSRDRQ(SEQ ID N0:2)或 IGSDGTV(SEQ ID N0:5);以及
[0022] CDR3，其包含序列 AARTASASGDWYKGSYQY (SEQ ID NO: 3)或 NAAGKRIGSDGSIWFAVASFGS(SEQ ID N0:6)〇
[0023] 上述分离的或纯化的抗体或其片段可包含序列GLTFRNFHMA(SEQ ID N0:1)的 CDR1，序列 ISWSRDRQ(SEQ ID N0:2)的CDR2,及序列 AARTASASGDWYKGSYQY(SEQ ID N0:3)的 CDR3。更特别是，分离的或纯化的抗体或其片段可包含以下序列：
[0024] QVX1LX2ESGGGLVQAGGSRRLSCATSGLTFRNFHMAWFRQVAGKEREVVX 3AISffSRDRQYYPDPVKGR FTX4TRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAARTASASGDWYKGSYQYWGQGTQVTVSS(SEQ ID N0:7),
[0025] 其中Xi=K或Q ;X2=E或V ;X3=A或C ;X4= I或C ;或基本上与之相同的序列。 在特定的非限制性例中，分离的或纯化的抗体或其片段可包含以下序列：
[0026] QVKLEESGGGLVQAGGSRRLSCATSGLTFRNFHMAWFRQVAGKEREVVAAISWSRDRQYYPDPVKGRFT ITRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAARTASASGDWYKGSYQYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:8)；
[0027] QVQLVESGGGLVQAGGSRRLSCATSGLTFRNFHMAWFRQVAGKEREVVAAISWSRDRQYYPDPVKGRFT ITRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAARTASASGDWYKGSYQYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:9)；
[0028] QVKLEESGGGLVQAGGSRRLSCATSGLTFRNFHMAWFRQVAGKEREVVCAISWSRDRQYYPDPVKGRFT CTRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAARTASASGDWYKGSYQYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:10)；
[0029] QVQLVESGGGLVQAGGSRRLSCATSGLTFRNFHMAWFRQVAGKEREVVCAISWSRDRQYYPDPVKGRFT CTRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAARTASASGDWYKGSYQYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:11)；
[0030] 或基本上与之相同的序列。
[0031] 或者，分离的或纯化的抗体或其片段可包含序列VSTFSINALG(SEQ ID N0:4)的 CDR1，序列 IGSDGTV(SEQ ID N0:5)的CDR2,及序列NAAGKRIGSDGSIWFAVASFGS(SEQ ID N0:6) 的CDR3。更特别是，分离的或纯化的抗体或其片段可包含以下序列：
[0032]qvx1lx2esggglvqaggslrvsctasvstfsinalgwyrqapgkarelvx 3aigsdgtvyytdsvkgrf tx4srdnakntvslqmsslkpedtavyycnaagkrigsdgsiwfavasfgswgqgtqvtvss(seqID NO:12),
[0033] 其中Xl=K或Q ;X2=E或V ;X3=A或C ;X4= I或C ;或基本上与之相同的序列。 在特定的非限制性例中，分离的或纯化的抗体或其片段