抗空肠弯曲杆菌抗体及其用图_4

文档序号:8547461阅读:来源:国知局
的序列。 在进一步非限制性例中,分离的或纯化的抗体或其片段可包含以下序列:
[0109] QVKLEESGGGLVQAGGSLRVSCTASVSTFSINALGWYRQAPGKARELVAAIGSDGTVYYTDSVKGRFTI SRDNAKNTVSLQMSSLKPEDTAVYYCNAAGKRIGSDGSIWFAVASFGSWGQGTQVTVSS(SEQ ID N0:13),也 在本文称为FlagV6M;
[0110] QVQLVESGGGLVQAGGSLRVSCTASVSTFSINALGWYRQAPGKARELVAAIGSDGTVYYTDSVKGRFTI SRDNAKNTVSLQMSSLKPEDTAVYYCNAAGKRIGSDGSIWFAVASFGSWGQGTQVTVSS(SEQ ID N0:14),也 在本文称为FlagV6F23M ;
[0111] QVKLEESGGGLVQAGGSLRVSCTASVSTFSINALGWYRQAPGKARELVCAIGSDGTVYYTDSVKGRFTC SRDNAKNTVSLQMSSLKPEDTAVYYCNAAGKRIGSDGSIWFAVASFGSWGQGTQVTVSS(SEQ ID N0:15),也 在本文称为FlagV6MDSB ;
[0112] QVQLVESGGGLVQAGGSLRVSCTASVSTFSINALGWYRQAPGKARELVCAIGSDGTVYYTDSVKGRFTC SRDNAKNTVSLQMSSLKPEDTAVYYCNAAGKRIGSDGSIWFAVASFGSWGQGTQVTVSS(SEQ ID N0:16),也 在本文称为FlagV6F23MDSB ;
[0113] 或基本上与之相同的序列。
[0114] 基本上同一序列可包含1个或更多保守性氨基酸突变。本领域知道,对参照序列 的1个或更多保守性氨基酸突变可产生在生理学,化学或功能性质上相比参照序列无实质 性变化的突变肽;在该情况中,参照和突变体序列会被认为是"基本上同一的"多肽。保守性 氨基酸突变可包括氨基酸的添加,缺失或取代;在一非限制性例中,保守性氨基酸突变是保 守性氨基酸取代。保守性氨基酸取代在本文被定义为氨基酸残基被具有类似化学性质(例 如尺寸,电荷或极性)的另一氨基酸残基取代。
[0115] 保守性氨基酸取代可用相同的组的另一氨基酸取代碱性,中性,疏水或酸性氨基 酸。术语"碱性氨基酸〃是指具有大于7的侧链pK值的亲水氨基酸,其一般在生理学pH带 正电。碱性氨基酸包括组氨酸(His或H),精氨酸(Arg或R),及赖氨酸(Lys或K)。术语 "中性氨基酸"(也被称为"极性氨基酸")是指具有在生理学pH不带电的侧链的亲水氨基 酸,但其具有至少1个由2个原子共享的电子对被其中一个原子更紧密把持的键。极性氨 基酸包括丝氨酸(Ser或S),苏氨酸(Thr或T),半胱氨酸(Cys或C),酪氨酸(Tyr或Y),天 冬酰胺(Asn或N),及谷氨酰胺(Gin或?。术语"疏水氨基酸"(也被称为"非-极性氨基 酸")旨在包括根据Eisenberg的标准化的共有疏水性尺度(1984)而呈现大于0的疏水性 的氨基酸。疏水氨基酸包括脯氨酸(Pro或P),异亮氨酸(lie或I),苯丙氨酸(Phe或F), 缬氨酸(Val或V),亮氨酸(Leu或L),色氨酸(Trp或W),甲硫氨酸(Met或M),丙氨酸(Ala 或A),及甘氨酸(Gly或G)。〃酸性氨基酸〃指称具有小于7的pK值的侧链的亲水氨基酸, 其一般在生理学pH带负电。酸性氨基酸包括谷氨酸(Glu或E),及天冬氨酸(Asp或D)。
[0116] 序列同一性用于评价2个序列的相似性;其通过计算当2个序列就残基位置之 间的最大对应对齐时相同的残基的百分率来确定。任何知道的方法可用于计算序列同一 性;例如,可利用计算机软件计算序列同一性。不旨在限制,序列同一性可由软件诸如由瑞 士生物信息学学会维持的NCBI BLAST2服务(及如见于ca. expasy. org/tools/blast/), BLAST-P,Blast-N或FASTA-N,或本领域所知的任何其他适当的软件计算。
[0117] 本发明的基本上同一序列可为在氨基酸水平与本文所述的序列至少90%同一; 在另一例中,基本上同一序列可为至少90,91,92,93,94,95,96,97,98,99或100%同一。例 如,及不旨在以任何方式限制,FlagVIM,FlagVlF23M,FlagVIMDSB和FlagVlF23MDSB的比对 导致96. 8%和98. 4%之间的序列同一性。重要的是,基本上同一序列保留参照序列的活性 和特异性。如为本领域技术人员所知,抗体的特定氨基酸残基,特别是框架区之内的可突变 而不影响抗体的抗原结合和其他功能性质。
[0118] 本发明的抗体或其片段也可包含附加序列,以辅助重组抗体或其片段的表达,检 测或纯化。例如,及不旨在限制,抗体或其片段可包含靶向或信号序列(例如,但不限于 ompA),检测标签(例如,但不限于c-Myc),纯化标签(例如但不限于组氨酸纯化标记His 5 或Hi s6),或其任何组合。
[0119] 本发明的抗体或其片段也可处于多价展示。多聚化可由本领域知道的任何适合的 方法达到。例如,及不旨在限于任何方式,多聚化可通过使用自身-组装分子达到(Zhang 等人,2004;Merritt&Hol,1995),如描述于W02003/046560。描述的方法通过表达包含本发 明的抗体或其片段和AB5毒素家族的B-亚基的五聚化结构域的融合蛋白来产生五聚抗体 (Nielson等人,2000 ;W02003/046560);例如,及不旨在限制,五聚化结构域的序列可为
[0120] TPDCVTGKVEYTKYNDEDTFTVKVGDKELFTNRANLQSLLLSAQITGMTVTIKTNACHNGGGFSEVIFR (SEQ ID N0:17)。
[0121] 五聚化结构域组装为五聚体,由此形成抗体或其片段的多价展示。如会被本领域 技术人员认识,五聚体中的各亚基包含上述融合蛋白。如也会容易被本领域技术人员认识, 抗体或其片段的五聚化无法改变其抗原结合或识别(即,抗体或其片段以相同的方式,以 相同的特异性和亲和性结合相同的抗原)。得到的五聚抗体是紧凑的,具有高亲合力(功能 亲和性),且为稳定的抗原-结合分子(Zhang等人,2004)。当与抗原结合时,这些五价抗 体也能增强凝集(Zhang等人,2004),由此增加它们的功效。
[0122] 本文所述的多聚体的各亚基可相同或不同。此外,多聚化结构域可使用接头 连接到抗体或抗体片段;该接头应具有足够的长度和适当的组成,以提供2个分子的 柔性的连接,但不应阻碍抗体的抗原-结合性质。在一非限制性例中,接头可为接头 GPGGGSGGGGS(SEQ ID N0:18)。
[0123] 在一特定非限制性例中,本发明的多聚体可包含序列
[0124] QVKLEESGGGLVQAGGSRRLSCATSGLTFRNFHMAWFRQVAGKEREVVAAISWSRDRQYYPDPVKGRFT ITRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAARTASAS⑶WYKGSYQYWGQGTQVTVSSGPGGGSGGGGSTPDCVTGKVE YTKYNDEDTFTVKVGDKELFTNRANLQSLLLSAQITGMTVTIKTNACHNGGGFSEVIFR(SEQ ID N0:19),也 在本文称为FlagVIP ;
[0125] QVQLVESGGGLVQAGGSRRLSCATSGLTFRNFHMAWFRQVAGKEREVVAAISWSRDRQYYPDPVKGRFT ITRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAARTASAS⑶WYKGSYQYWGQGTQVTVSSGPGGGSGGGGSTPDCVTGKVE YTKYNDEDTFTVKVGDKELFTNRANLQSLLLSAQITGMTVTIKTNACHNGGGFSEVIFR(SEQ ID N0:20),也 在本文称为FlagVlF23P ;
[0126] QVKLEESGGGLVQAGGSRRLSCATSGLTFRNFHMAWFRQVAGKEREVVCAISWSRDRQYYPDPVKGRFT CTRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAARTASAS⑶WYKGSYQYWGQGTQVTVSSGPGGGSGGGGSTPDCVTGKVE YTKYNDEDTFTVKVGDKELFTNRANLQSLLLSAQITGMTVTIKTNACHNGGGFSEVIFR(SEQ ID N0:34),也 在本文称为FlagVIPDSB ;
[0127] QVQLVESGGGLVQAGGSRRLSCATSGLTFRNFHMAWFRQVAGKEREVVCAISWSRDRQYYPDPVKGRFT CTRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAARTASAS⑶WYKGSYQYWGQGTQVTVSSGPGGGSGGGGSTPDCVTGKVE YTKYNDEDTFTVKVGDKELFTNRANLQSLLLSAQITGMTVTIKTNACHNGGGFSEVIFR(SEQ ID N0:35),也 在本文称为FlagVlF23PDSB ;
[0128] QVKLEESGGGLVQAGGSLRVSCTASVSTFSINALGWYRQAPGKARELVAAIGSDGTVYYTDSVKGRFTI SRDNAKNTVSLQMSSLKPEDTAVYYCNAAGKRIGSDGSIWFAVASFGSWGQGTQVTVSSGPGGGSGGGGSTPDCVTG KVEYTKYNDEDTFTVKVGDKELFTNRANLQSLLLSAQITGMTVTIKTNACHNGGGFSEVIFR(SEQ ID NO:21), 也在本文称为FlagV6P ;
[0129] QVQLVESGGGLVQAGGSLRVSCTASVSTFSINALGWYRQAPGKARELVAAIGSDGTVYYTDSVKGRFTI SRDNAKNTVSLQMSSLKPEDTAVYYCNAAGKRIGSDGSIWFAVASFGSWGQGTQVTVSSGPGGGSGGGGSTPDCVTG KVEYTKYNDEDTFTVKVGDKELFTNRANLQSLLLSAQITGMTVTIKTNACHNGGGFSEVIFR(SEQ ID NO:22), 也在本文称为FlagV6F23P,
[0130] QVKLEESGGGLVQAGGSLRVSCTASVSTFSINALGWYRQAPGKARELVCAIGSDGTVYYTDSVKGRFTC SRDNAKNTVSLQMSSLKPEDTAVYYCNAAGKRIGSDGSIWFAVASFGSWGQGTQVTVSSGPGGGSGGGGSTPDCVTG KVEYTKYNDEDTFTVKVGDKELFTNRANLQSLLLSAQITGMTVTIKTNACHNGGGFSEVIFR(SEQ ID NO:36), 也在本文称为FlagV6PDSB ;
[0131] QVQLVESGGGLVQAGGSLRVSCTASVSTFSINALGWYRQAPGKARELVCAIGSDGTVYYTDSVKGRFTC SRDNAKNTVSLQMSSLKPEDTAVYYCNAAGKRIGSDGSIWFAVASFGSWGQGTQVTVSSGPGGGSGGGGSTPDCVTG KVEYTKYNDEDTFTVKVGDKELFTNRANLQSLLLSAQITGMTVTIKTNACHNGGGFSEVIFR(SEQ ID NO:16), 也在本文称为FlagV6F23PDSB ;
[0132] 或基本上与之相同的序列。
[0133] 本发明也包括其他形式的多价展示。例如,及不旨在限制,抗体或其片段可作为 二聚体,三聚体,或任何其他适合的寡聚体存在。此可由本领域知道的方法,例如直接连接 (Nielsen等人,2000),c-jun/Fos相互作用(de Kruif等人,1996),"凸至凹"相互作用 (Ridgway等人,1996)达到。多聚体也可通过使用由Zhu等人(2010)描述的多聚化结构域 形成;此形式在本文被称为"共抗体"形式,是本发明的抗体或片段与卷曲的-线圈肽的融 合产生多聚体分子(Zhu等人,2010)。
[0134] 本领域知道的用于多聚化的另一方法是使用Fc结构域二聚化抗体或其片段。在 此方法中,Fc基因被插入表达载体;抗体或其片段的核苷酸序列可扩增及被插入载体,使 得抗体或其片段的C-端连接到Fc的铰链区而不添加额外残基。得到的载体可转染到哺乳 动物细胞系,和融合蛋白可重组表达,然后由亲和层析(例如,在蛋白A柱上)纯化。该多 聚化方法的一个非限制性例被Bell等人(2010)和Iqbal等人(出版中)描述。实施该二 聚化的技术为本领域技术人员所知。
[0135] 在上述多聚体中,多聚体之内的亚基可包含本发明的相同或不同抗体或其片段。
[0136] 本发明也包括编码本文所述的抗体或其片段的核酸序列。基于遗传密码的简并 性,许多核苷酸序列会具有编码多肽的效应,如由本领域技术人员容易明白。核酸序列可为 密码子_优化的。本发明也包括包含如上所述的核酸的载体。
[0137] 包含编码本文所述的抗体或其片段中的任何一种的核苷酸的宿主细胞也会由本 领域技术人员容易识别。
[0138] 也包括包含本文所述的抗体或其片段和/或作为与病毒包被蛋白之一(例如,但 不限于丝状噬菌体的g3p)融合展示,和/或包含编码抗体或其片段的核苷酸的噬菌体。
[0139] 可将本文所述的抗体或其片段用可检测的标记物标记。标记物可致使可检测, 或可本身是可检测的,从而可观察空肠弯曲杆菌(C. jejuni)的结合的存在。可检测的标 记物可为放射性同位素,顺磁性标记物(例如氧化钆或铁),荧光团,荧光团,荧光剂(例 如,FITC或增强的绿色荧光蛋白(EGFP)),近红外(NIR ;例如Cy5. 5, Alexa680, Dylight680 或DylightSOO)荧光色素或染料,回声微气泡,亲和性标记物(例如生物素,亲和素,等), 与可检测的基于蛋白的分子,核苷酸,量子点,纳米粒子,纳米线或纳米管或可通过成像方 法检测的任何其他适合的剂融合。抗体或其片段可使用本领域知道的任何方法(重组技 术,化学缀合,等)连接到可检测的剂;可任选地根据需要使用接头。检测步骤可由本领 域知道的任何适合的方法,例如但不限于光学成像免疫组织化学或分子诊断成像,ELISA或 其他适合的方法实现。在特定非限制性例中,抗体或其片段可连接到荧光剂诸如FITC,或可 遗传融合到增强的绿色荧光蛋白(EGFP)。
[0140] 在本文描述了减少动物或动物环境中空肠弯曲杆菌(C. jejuni)的存在的方法。 在个体动物之内,减少存在可包含减少在动物表面,或动物的消化道之内混杂。当动物被 全身感染时,本文所述的方法可用于减少空肠弯曲杆菌(C. jejuni)的存在。动物环境可 涉及动物的立即周围,诸如笼或设备的壁或底,动物场内的补给或给水设备,见于在动物场 的垫材,或简单地动物区限之内的动物外部存在的粪便物质。给动物施用本文所述的抗体 或其片段可旨在减少施用抗体或其片段的动物内,或该动物的后代,或畜群之内,动物生活 的笼或仓中的空肠弯曲杆菌(C. jejuni)的存在。减少动物的消化道之内的空肠弯曲杆菌 (C. jejuni)是减少动物的环境之内混杂的一种方式,导致更安全食品供应链,伴随降低混 杂的发生率。
[0141] 给动物施用可由本领域知道的任何适合的方法。有利地,本文所述的抗体或其片 段可经口施用。口腔递送允许在给动物的水或食品供应之内递送抗体或其片段,及相比注 射,对动物欠可检测或欠应激。当期望口腔施剂方案的高度精确的递送时,强饲也是可接受 的口腔途径。其他施用途径也可考虑,诸如经系统性,或直肠递送途径。例如,及不旨在以 任何方式限制,抗体或其片段可包括在动物的食品供应中。在一非限制性例中,抗体或其片 段可在包括在动物的食品供应中的酵母表达系统中提供。在非限制性例中,抗体或其片段 可在酵母包被蛋白展示,或由酵母内部或外部表达。
[0142] 有效抵抗空肠弯曲杆菌
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