（C. jejuni)的另一物质的共施用也是减少动物环境中 的空肠弯曲杆菌（C. jejuni)的可能的策略。例如，在递送抗体或其片段的同时或在相邻 时间给动物施用抗生素可具有加和效应或可具有协同效应。其结果是减小空肠弯曲杆菌 (C. jejuni)混杂的似然性，而且减少抗生素的利用。也可为加和或协同效应，随抗体或其片 段给动物提供针对空肠弯曲杆菌（C. jejuni)有效的细菌素。除细菌素外，或作为细菌素的 替代品，可与本文所述的抗体或其片段一起使用具有针对空肠弯曲杆菌（c. jejuni)的效 应的任何其他植物来源的或动物来源的化合物，诸如小分子，肽或蛋白。也可与抗体或其片 段同时给动物提供竞争性微生物，以便达到加和或协同效应。竞争性微生物可作为益生系 统的部分与本文所述的抗体或其片段一起使用。在该益生系统之内，抗体或其片段可与竞 争性微生物共施用，或可依次递送。也可进行在益生系统内本文所述的抗体或其片段的表 达。
[0143] 在CDR区之外的抗体或其片段的部分的支架加工可赋予另外的蛋白酶抗性，以及 热和低pH抗性。递送形式也可随提供针对肠酶，热或低pH效应的保护性效应的包被或赋 形剂而改变，及以此方式，不需修饰抗体或其片段本身的序列，而是为口腔递送制备的制剂 可本身就递送抗体或其片段的受试者物种优化。
[0144]剂型可具有对于给动物递送肽可接受的任何类型。如果期望，可使用包被的形式 和慢释放形式。可使用液体，粉，晶体，凝胶，半-固体或片剂形式。
[0145] 可递送抗体或其片段的动物可为鸟，诸如肉鸡或产蛋鸡。如果空肠弯曲杆菌 (C. jejuni)存在于动物的肠或周围环境中，其他类型的家畜动物，诸如牛，绵羊，等也可受 益于肽。由此，家畜应用不限于家禽。典型动物环境可为仓或农场，诸如家禽饲养场。为了 避免基本上无空肠弯曲杆菌（C. jejuni)的动物环境污染，提供防止向环境，诸如仓导入新 混杂的动物或"应招者"动物的方法。在该方法中，在将应招者动物导入动物环境，诸如仓 或农场之前，给应招者施用抗体或其片段。以此方式，动物可在与可已接收了治疗的其他动 物居住之前清除混杂的似然性。
[0146] 在本文描述抗-空肠弯曲杆菌（C. jejuni)疫苗，其包含本文所述的抗体或其片 段，及赋形剂。疫苗可配制用于口腔递送，如上所述。
[0147] 也描述治疗空肠弯曲杆菌（C. jejuni)感染的受试者的方法，包括给受试者施用 上述抗体或其片段。任选地，可给受试者共施用针对空肠弯曲杆菌（C. jejuni)有效的抗生 素。而受试者可为家畜，诸如鸡，方法也可应用于人受试者。
[0148]用在治疗空肠弯曲杆菌（C. jejuni)感染的制剂包含抗体或其片段及赋形剂。由 此，抗体或其片段可用于制备治疗有需求的受试者中空肠弯曲杆菌（C. jejuni)感染的药 物。
[0149]本文所述的抗体或其片段也对于检测样品中的空肠弯曲杆菌（C. jejuni)的方法 有用。在该方法中，在有或无标记物存在下，使样品与抗体或其片段接触，及随后，通过使用 任何可接受的手段检测结合的抗体或其片段的存在。对于检测用于测定个体的混杂或感染 的那些实例，样品可包含体液或粪便物质。在评定食品中，或食品加工环境中空肠弯曲杆菌 (C. jejuni)的存在的实施方式中，与抗体或其片段接触的样品可为食品，食品容器，食品加 工设备，或来自食品的表面拭子，容器或加工设备。
[0150] 为实施该方法提供试剂盒，其会包括抗体或其片段本身，及用于检测空肠弯曲杆 菌（C. jejuni)的使用说明。任选地，可为用户的便利包括用于该检测试剂盒的试剂。
[0151]抗体或其片段本身可为用于检测样品中的空肠弯曲杆菌（C. jejuni)的检测试剂 的主要成分。该检测试剂也可有适合的载体，诸如缓冲剂。
[0152]本发明人通过针对鞭毛蛋白淘选分离了 FlagVIM和FlagV6M，分离自超免疫的羊 驼噬菌体展示库的鞭毛蛋白-结合单结构域抗体（sdAb)。从库分离FlagVlF23M，其中错 配PCR方法用于在FlagVIM DNA中导入随机突变；淘选在蛋白酶处理条件下实施。也赋予 FlagV6M相当的突变，产生FlagV6F23M。通过使sdAb与源于vero细胞毒素B同源五聚体 的蛋白结构域融合来赋予FlagVIM，FlagVlF23M和FlagV6M抗体五价，产生蛋白FlagVIP， FlagVlF23P和FlagV6P。得到的抗体或其片段，其可被称为"五聚抗体"，是紧凑的，显示高 亲合力，且为稳定的抗原-结合分子。当与抗原结合时，这些五价VhH能增强空肠弯曲杆菌 (C. jejuni)及结肠弯曲杆菌（C. coli)的凝集。
[0153] 相比常规抗体片段，单结构域抗体，一般而言，对蛋白酶显著地更抗性。但是， FlagVIM，FlagVlF23M，FlagV6M和FlagV6F23M也被修饰而具有增加的对肠酶的耐受性，由 此增加口腔递送的功效。可对于多肽具有毁坏性效应的典型肠酶包括胃蛋白酶，胰蛋白酶 和糜蛋白酶。由此，对这些酶的抗性是有利的，由于肽会具有更多曝露时间，以与肠道内 的环境空肠弯曲杆菌（C. jejuni)结合。通过在残基54和78之间导入第2二硫桥来制 造对 FlagVIM，FlagVlF23M，FlagV6M 和 FlagV6F23M 的修饰，分别产生 sdAb FlagVIMDSB， FlagVlF23MDSB，FlagV6MDSB和FlagV6F23MDSB。当在特定位点导入半胱氨酸残基时，基于 对VhH热稳定性和蛋白水解稳定性的最佳改变选择制备二硫桥修饰的抗体中的修饰用位 点。
[0154]VhH和五聚抗体对应物特异于鞭毛蛋白，空肠弯曲杆菌（C. jejuni)细胞表面抗 原，如由荧光显微镜检展示。此外，发明人展示，针对鞭毛蛋白发展的五聚抗体与flaA蛋白 (其在侵袭哺乳动物细胞中起到作用）结合。SPR展示，VhH对靶具有低nM亲和性。VhH也 能防止/破坏弯曲杆菌属（Campylobacter)生长和运动性，如在运动性测定中展示。当经 口施用时，VhH也显著地减小鸡中空肠弯曲杆菌（C. jejuni)定居水平。此外，弯曲杆菌属 (Campylobacter)控制中抗体和抗生素的组合的治疗研宄显示，施用VhH和五聚抗体可降低 抗生素的需要的剂量达35倍。
[0155] 本发明还会在下列实施例中例示。但是，需知，这些例仅用于展示性目的，和不应 用于以任何方式限制本发明的范围。
[0156]【实施例1:抗原的制备】
[0157] 在随后例中制备鞭毛用作抗原。
[0158] 如之前描述分离空肠弯曲杆菌（C. jejuni)(株81-176)鞭毛（功率等 人，2003)。简言之，为制备鞭毛，将空肠弯曲杆菌（C. jejuni)培养过夜，和刮下细胞放入 Muller-Hinton肉汤，及温育过夜。然后通过离心及重悬浮于100mL的Tris-缓冲的盐溶液 来收获细胞。使用Waring混合器在冰上自细胞剪切鞭毛。通过离心使细胞碎片沉淀，和将 上清液转移到超速离心管。通过以45, OOOrpm离心1小时使鞭毛沉淀。通过重悬浮于2% SDS和样品的离心来进行进一步纯化。使沉淀重悬浮于200~500 y L的dH20。
[0159]【实施例2 :羊驼免疫和血清应答】
[0160] 为了分离靶向空肠弯曲杆菌（C. jejuni)鞭毛的VhH，将羊驼用在实施例1中获得 的鞭毛抗原免疫。
[0161] 将雄性羊蛇（Lama glama)用空肠弯曲杆菌（C. jejuni)鞭毛皮下免疫（实施例 1)。总共实施7次注射及，为各次注射，将0. 5ml总体积中的100 y g的抗原与等同体积的 完全（第1天）或不完全的（第21天，35, 49, 63)弗氏佐剂（Sigma)混合。用100 y g的 无佐剂的抗原实施最后2次注射（第76和90天）。在第1次注射之前及在第21，49, 76和 90天收集免疫前血（15~20ml)。特定免疫应答由ELISA使用总免疫前和免疫血清分析。 将来自第90天的羊蛇血清根据Hamers-Casterman等人（1993)分级分离。根据生产商的 使用说明，将蛋白G和A柱（GE HEALTHCARE)用于血清分级分离，及用1M Tris/HCl(pH8.8) 将分离的级分调整到PH6,及针对预冷却的PBS于4°C过夜透析。就与鞭毛的特异性结合， 由ELISA分析个体重级分（Gl，A1和A2)和G2 (常规IgG)。简言之，将微孔板（Maxisorp? 板）（Nalge Nunc国际，Rochester, NY)用PBS中的5 y g/ml的鞭毛抗原（实施例1)，于 4°C包被过夜。将孔漂洗及用200 yl的1%酪蛋白阻断。添加纯化的IgG级分（G1，G2，A1 和A2)的不同稀释及于室温温育1.5h。将孔用PBST(0. 05% v/v吐温-20)洗涤，及与山羊 抗-羊蛇 IgG(H+L) (PBS 中 1:1,000) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX)温育、之后与 猪类-抗-山羊-HRP(PBS 中 l:3,000)(Cedarlane，Burlington，0N,加拿大）温育。通过 添加 100 y 1/ 孔 TMB 过氧化物酶底物（Kirkegaard 和 Perry Laboratories, Gaithersburg ，MD, USA)来检测信号。通过添加1001M磷酸来停止反应，和通过使用Bio-Rad ELISA平板 读数仪测量A45(i。
[0162] SDS-PAGE确认羊驼血清级分的纯度（Gl，G2, A1和A2 ;数据未显示）。当与免疫前 出血比较时，在针对鞭毛抗原的重链以及常规部分中，级分的ELISA显示强免疫应答（数据 不显示的）。这些结果是也与自总血清获得的ELISA结果可比较（数据未显示）。
[0163]【实施例3 :鞭毛-结合VhH的库构建和选择】
[0164] 基于分离自在实施例2中收集的血清的RNA构建超免疫的羊驼VhH库。
[0165] 如之前描述构建噬菌体展示库（Arbabi Ghahroudi等人，2009)。简言之， 从在免疫后第90天收集的大致1 X 107淋巴细胞，使用QIAamp RNA血小型试剂盒 (Qiagen, Mississauga, Ontario,加拿大）分离总 RNA。用寡（dT)引物，使用 5 y g 总 RNA 作为模板，根据生产商的建议（GE HEALTHCARE)合成第1-链cDNA (Arbabi Ghahroudi等 人，2009)。通过使用寡核苷酸MJ1-3 (正义）和2种CH2结构域反义引物CH2和CH2b3 (引 物序列见Arbabi Ghahroudi等人，2009)扩增可变和部分恒定区DNA，和将重链片段（长 度550~650bp)通过使用QIA快速凝胶提取试剂盒（Qiagene)凝胶-纯化。将重链抗 体（IgG2和IgG3)的可变区在第2PCR反应中使用MJ7和MJ8引物（引物序列见Arbabi Ghahroudi等人，2009)再扩增。扩增的PCR产物用QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagene) 纯化，用 Sfil (New England BioLabs, Pickering, Ontario,加拿大）消化，及通过使用相 同的试剂盒再纯化。将12 y g的消化的VhH片段与40 y g(分别3:1摩尔比）Sfi-消化的 pMEDl噬菌粒载体（Arbabi Ghahroudi等人，2009)使用LigaFast快速DNA连接系统和其 流程（Promega，Madison，WI)连接，转化进商业电感受态TG1大肠埃希氏菌（E. coli)细胞 (Stratagene, La Jolla, CA)，如之前描述（Arbabi Ghahroudi 等人，2009)，和获得 5 X107 转化体的库尺寸。将来自30个集落的VhH片段PCR-扩增及测序，以分析库的复杂性；全部 克隆具有预期的尺寸的插入子，及在它们的CDR区彼此不同，如通过测序它们的编码VhH片 段来测定。使库于37°C，以250rpm，在2X YT/Amp-葡萄糖（2% w/v)培养基中生长3~4 小时。使细菌细胞沉淀，在相同的培养基中重悬浮，及作为甘油浓储物存储于_80°C，如之前 描述（Arbabi Ghahroudi 等人，2009)。
[0166] 基本上如之前描述（Arbabi Ghahroudi等人，1997和2009)实施淘选实验。针对 鞭毛抗原实施总共4轮淘选。使2ml的库浓储物于37°C，250rpm在2X YT/Amp-葡萄糖（2% w/v)培养基（A_= 0? 4~0? 5)中生长1~2小时，用M13K07辅助噬菌体（New England Biolobas)于37°C感染1小时。在将培养物于4°C离心之后，使感染的细胞沉淀重悬浮于 含50 y g/ml卡那霉素的200ml的2X YT/Amp，及于37°C和250rpm温育过夜。如之前描述 使培养上清液中的噬菌体粒子PEG-沉淀（Arbabi-Ghahroudi等人，2009)，和使噬菌体沉淀 重悬浮于2ml的无菌PBS，和测定菌体滴定。将96-孔Maxisorp?板用30 y g的鞭毛抗原 于4°C包被过夜。将孔用PBS漂洗，及用PBS/1% (w/v)酪蛋白于37°C阻断2h。将大致1012 拯救的噬菌体粒子加入阻断的孔，及于37°C温育2小时。将孔用PBST (0. 1 % v/v吐温-20) 洗涤5次，和用PBS洗涤5次。将结合的噬菌体用0. 1M三乙基胺洗脱，用1M Tris-HCL(PH 7.4)中和，及与指数地生长的TG1细胞温育。在于37°C温育30min之后，将细胞用M13K07 超感染另外的15min，及在2X YT-Amp-Kan中于37°C生长过夜。根据相同的条件再持续3 轮淘选，除了分别为第2,第3和第4轮淘选，抗原浓度降至20,15和10 yg/孔，及用PBS-T 和PBS洗涤增加7,10和12次之外。在4轮的之后淘选，使48个随机挑选的集落生长，及使 经历噬菌体ELISA筛选，如之前描述（Arbabi Ghahroudi等人，2009)，除了在微孔板上包被 5μg/ml 的鞭毛之外。阳性克隆包括 FlagVIM 和 FlagV6M(SEQ ID N0:8 和 SEQ ID N0:13; 图1)，对其进行进一步研宄。
[0167]【实施例4 :单体VhH的表达和纯化】
[0168] 自pMEDl噬菌粒载体，用Bbsll-VHH正向引物和8 &1^1-￥1111反向引物（表1)PCR扩 增针对在实施例3中鉴定的鞭毛的VhH。将PCR片段用Bbsl和BamHI限制酶消化，及连接 进类似地消化的PSJF2H表达载体（Arbabi-Ghahroudi等人，2009)。连接之后，将全部质粒 转化进电感受态TG1大肠埃希氏菌（E. coli)及在LB琼脂板+氨节西林上选择。由对于插 入子的集落PCR筛选集落，和进行DNA测序。
[0169] 通过使用5天最小培养基方法表达VhH抗体（Arbabi-Ghahroudi等人，2009)。 在诱导蛋白表达之后，以6,000印11^301^11(4°〇收获细胞培养物，将上清液滗析，及自 细胞沉淀提取周质内容物。简言之，使单体VhH沉淀重悬浮于20ml的冰冷的TES(0. 2M Tris-HCl pH8. 0,20% (w/v)蔗糖，0.5mM EDTA)，及在冰上温育 30min。接下来，添加 30ml 的冰冷的l/8TES(dH20中稀释的），在冰上温育另外的30min，及将浆以12,000rpm离心 30min(4°C )。将得到的含有VhH的上清液向固定的金属-亲和层析（IMAC)缓冲剂A(10mM HEPES pH7.0,500mM NaCl)透析过夜，及如描述纯化（Arbabi-Ghahroudi 等人，2009)。抗 体的纯化通过使用HiTrap?螯合HP柱（GE HEALTHCARE)，根据使用说明进行。在入KTA FPLC 纯化系统（GE HEALTHCARE)上，用 10mM HEPES，500mM NaCl，pH7. 0 作为起始缓冲剂和 用10mM HEPES，500mM NaCl，500mM咪唑，pH7. 0作为