通过在酿酒酵母中的表达产生可分泌抗体的方法

通过在酿酒酵母中的表达产生可分泌抗体的方法
【专利说明】通过在酿酒酵母中的表达产生可分泌抗体的方法
[0001] 发明丰题 本发明涉及用于在酿酒酵母（cererisiae)细胞的表面上产生和非共 价表面呈递抗体和衍生片段以及基于其的分子文库的方法。表面呈递的非共价方式使得可 能借助高通量筛选选择特定变体和随后所选结合分子可切换分泌至培养上清液用于生化 表征。
[0002] 本发明还涉及用于在酵母细胞的表面上呈递抗体或抗体文库和筛选这些文库的 具有特别期望特性的免疫球蛋白的方法。
[0003] 发明背景 单克隆抗体的发现已经从杂交瘤技术进化，在其帮助下，可以以特异性方式产生具有 特定特异性和亲和力的抗体。由其开发的组合文库，包括筛选和选择方法，已经发展成标准 工具，用于通常修饰蛋白的结合特性。
[0004] 用于生成和筛选抗体文库的最普遍的技术曾经是"噬菌体呈递"方法，并且在一些 情况下仍然是"噬菌体呈递"方法，其中特定目标蛋白可以在噬菌体外壳蛋白上表达为融合 多肽，并且通过结合至固定或可溶性生物素化的配体而选择。已经以这种方式构建的噬菌 体可被视为紧凑遗传单元，其已经在表型和基因型特性两者方面自身组合。抗体、抗体片 段、酶、DNA结合蛋白等上已经非常成功地使用噬菌体呈递。通过在称为"淘选"的过程中结 合至固定抗原选择具有期望结合特性的抗体。洗出含有非特异性抗体的噬菌体，将结合的 噬菌体分离且在大肠杆菌中扩增。该设置已用于生成大量抗原特异性抗体。尽管如此，噬 菌体呈递技术具有一些基本缺陷和困难，其限制了其用途，特别是在真核蛋白的产生中。因 此，例如，可以分离非常高亲和力的抗体，并且仅困难地通过"淘选"进一步处理。此外，可 以影响抗体的特异性和亲和力的翻译后修饰，诸如例如糖基化，用噬菌体呈递方法是不可 能的。
[0005] -种替代方案是使用低等真核系统，诸如酵母。与在丝状噬菌体的情况下相比， B细胞呈递抗体和酵母细胞呈递抗体之间的结构相似性使得更接近类似于体内"亲和力成 熟"。因为具体地真核细胞诸如酵母能够产生糖基化蛋白，而丝状噬菌体不能做到这一点， 来自真核宿主细胞的单克隆抗体应当具有比来自噬菌体的抗体更类似于人或哺乳动物的 特性。此外，在酵母中克隆、表达和修饰抗体特别已经证明在方法和实用性方面是有效和简 单的。US 6, 699, 658描述了，例如，酵母细胞表面呈递方法，在其帮助下，组合抗体文库的筛 选和生产已经变得可能。所述"酵母表面呈递"技术基于用表达融合至酵母细胞壁蛋白的 免疫球蛋白的载体转染酵母细胞，采用诱变以便生成免疫球蛋白变体的多样性且以便然后 根据期望表型特性选择这些细胞。该技术由Boder和Wittrup在1997年建立。他们首次 成功地在酵母细胞的表面上功能呈递组合文库的scFv片段，通过流式细胞术筛选它们，并 且分离对于抗原具有增加亲和力的scFv片段。基因型和表型的稳定偶联使其变得可能，因 为scFv片段被呈递为具有酵母固有的细胞壁蛋白的融合蛋白。据推测，通过使用基于酵母 的呈递技术实现的最重要成就是荧光激活的细胞分选（FACS)的直接适用性，这在有效筛 选大变体文库中是决定性的。稳定的基因型-表型偶联通过异源蛋白与酿酒酵母的外细 胞壁的蛋白的融合来实现。由此实现的蛋白暴露是与抗原相互作用的前提条件。
[0006] 然而，如Wittrup和Boder开发的刚刚描述的酵母表面呈递特别具有一些实际缺 点。一个缺点是，例如，各种表达的蛋白无法获得，或者只能用相同的酵母细胞不令人满意 地获得。此外，通过Wittrup的方法，期望的免疫球蛋白共价结合至细胞壁蛋白，并且必须 通过另外的方法步骤进行分离。
[0007] W0 2010/005863描述了基于巴斯德毕赤酵母种的酵母细胞的相应酵母表面呈递 系统，其中免疫球蛋白非共价地结合至蛋白A的ZZ结构域，其中当用于表达所述蛋白的相 应多种启动子以正确的时间顺序开启或关闭时，包含细胞壁蛋白凝集素或其亚单位和ZZ 结构域和免疫球蛋白的融合蛋白仅在酵母细胞中同时表达且分泌，以便被呈递在细胞表面 上。
[0008] 发明概沐 本发明涉及开发用于在酵母种酿酒酵母细胞的表面上非共价表面呈递抗体和衍生片 段以及基于其的分子文库的方法。表面呈递的非共价方式意欲使得可能借助高通量筛选选 择特定变体和随后所选结合分子可切换分泌至培养上清液用于生化表征。
[0009] 焦点是选择和生产的成功组合，其节约时间地省略亚克隆和重新格式化步骤，诸 如在已知相当方法中必需的步骤，诸如例如噬菌体上的蛋白表面呈递。该组合导致抗体的 活性成分发现中的后续过程的简化和加速。通过本身已知的使用Fc结合结构域、优选来自 金黄色葡萄球菌蛋白A的ZZ结构域作为表面呈递的介体，可以在酵母细胞上成功地呈递抗 体、生物活性抗体片段和抗体结构域，诸如，例如，VHH-Fc融合蛋白（由两条蛋白链组成）。
[0010] 令人惊讶地，通过使用酵母酿酒酵母作为宿主生物体，在表面呈递过程中已经选 择蛋白的正确折叠、分泌和稳定性，因为作为真核生物，该酵母在蛋白合成过程中具有质量 控制的机制。通过此处呈现的方法，可以在酵母细胞的表面上以对其用途特异性的最终形 式呈递VHH-Fc融合蛋白和更复杂的蛋白，诸如整个抗体，并且以这种方式，能够使用蛋白 工程改造的方法。其后，所选克隆可以直接用于产生蛋白。
[0011] 因此，本发明提供用于通过表达、分泌和将其呈递在酵母细胞的表面上而产生多 种IgG分子，诸如抗体、生物活性抗体片段或具有特定特性的抗体结构域的方法，其中根据 本发明的方法包括以下步骤： (a) 提供酵母种酿酒酵母的宿主细胞，其已经用合适质粒的形式的第一和第二核酸分 子转染，其中所述第一核酸分子编码融合蛋白，所述融合蛋白基本上包含细胞表面锚定蛋 白、Fc结合结构域和可调节启动子，所述可调节启动子根据培养条件控制所述融合蛋白的 表达，并且所述第二核酸分子编码所述抗体群体，所述抗体片段或抗体结构域呈其轻链和 重链的形式，并且在永久活性启动子的控制下， (b) 通过在培养基中存在具有> 5, 000的分子量的聚乙二醇（PEG)的情况下在酵母细 胞中同时共表达多种抗体、抗体片段或抗体结构域而表达所述融合蛋白，其中所述IgG分 子以及融合蛋白以可溶性形式从酵母细胞分泌， (c) 在所述酵母细胞的表面上呈递多种抗体、抗体片段或抗体结构域，其以非共价形 式结合至表达的锚定至细胞表面的融合蛋白的Fc结合结构域， (d) 根据结合至Fc结合结构域的多种抗体、生物活性抗体片段或抗体结构域的期望 的不同的表型或结合特性，在结合至融合蛋白或Ig分子或其中含有的检测标记的帮助下 选择和分离酵母细胞， (e) 在不允许或基本不允许进一步表达融合蛋白的培养条件下在特定选择的酵母细 胞群体中表达多种抗体、生物活性抗体片段或抗体结构域，和 (f) 从培养基分离具有所选表型或结合特性的多种抗体。
[0012] 与此相反，在根据W0 2010/0058863的方法中，在巴斯德毕赤酵母中表达本身相 同的融合蛋白和免疫球蛋白不同时进行：反而，该系统只有当通过活化负责的启动子诱导 和操作细胞表面"捕获"分子的表达才在一定程度上有效地发挥作用，而没有同时发生免疫 球蛋白的轻链和重链的值得注意的表达。在捕获分子的表达已经由于经由可调控启动子抑 制而停止之后，这仅在第二步骤中实现。
[0013] 令人惊讶地，这在根据本发明的方法中是不必要的。尽管初始活化Fc结合结构域 的启动子，Ig分子的表达已经可以同时发生。当Fc结合结构域已经在酵母细胞中充分表 达和分泌时，为了最终结合至细胞表面，且同时共表达和共分泌Ig，在Fc结合结构域的启 动子已经关闭后，Ig分子的表达继续发生，并且这些在其分泌后非共价结合至游离的Fc结 合结构域。这完全更令人惊讶，因为在W0 2010/0058863中，原则上采用相同或非常相似的 细胞壁表面蛋白（作为锚定蛋白）和相同的Fc结合结构域（ZZ结构域）。根据本发明的 方法中的差异因此似乎在于不同的酵母种（酿酒酵母相比于巴斯德毕赤酵母）和使用较高 分子量聚乙二醇。已经发现，使用具有> 5, 000、特别是> 6, 000、特别是> 7, 000且优选〉 8, 000的分子量的PEG导致细胞表面上遇到的Ig分子的显著增加，其据推测伴随由PEG增 加的分泌。令人惊讶地，如果省略PEG或采用具有较低分子量（〈5000,特别是〈7000,特别 是〈8000)的PEG，则在细胞表面上观察到不足数目的结合的Ig分子，这可能也解释与TO 2010/005863的方法的差异。通常，在酿酒酵母上特别是整个Ig分子的分泌和表面呈递迄 今为止已被证明是复杂的。
[0014] 与来自W0 2010/005863的方法相反，在根据本发明的本方法中，仅蛋白（即细胞 壁蛋白和Fc结合结构域的融合蛋白）的表达已被调节，优选通过GAL1启动子调节，而IgG 分子，例如VHH-Fc融合蛋白永久表达，也就是组成型表达，无论包含Fc结合结构域的其它 蛋白的表达。
[0015] 根据本发明，凝集素，特别是a_凝集素，被用作细胞壁锚定蛋白。这与其亚单位 agalp直接结合至细胞壁。在酵母细胞中表达且经由二硫键结合至agalp的根据本发明的 融合蛋白包含凝集素的第二亚单位，aga2p，其C末端结合至来自蛋白A的ZZ结构域。 [0016] 因此，本发明还提供了相应的方法，其中细胞表面锚定蛋白是a _凝集素或a _凝 集素，且融合蛋白包含aga2p和Fc结合结构域，优选来自金黄色葡萄球菌的蛋白A的ZZ结 构域。
[0017] 因此，本发明特别提供其中ZZ结构域和aga2p的融合蛋白的表达（和分泌）受 GAL1启动子调节的方法。
[0018] 本发明还特别提供其中抗体、抗体片段或抗体结构域的表达（和分泌）在GAPDH 启动子的控制下的方法，其中表达组成型发生，用于表达ZZ结构域和aga2p亚单位的融合 蛋白。
[0019] 本发明还提供了相应的方法，其中在表达/分泌中，在表达培养基中采用具有〉 5, 000、特别是> 7, 000 - 8, 000的分子量的PEG，优选PEG8000。
[0020] 最后，本发明提供用于产生用于生成和选择具有所选表型或结合特性的整个抗 体、Fab片段或其它生物活性抗体结构域的抗体文库的相应方法。
[0021] 发明详沐 通常，根据本发明的方法中采用的免疫球蛋白是IgG、IgA、IgE或IgM分子，但优选IgG 分子，其包括 IgGl、IgG2、IgG3 和 IgG4。
[0022] 术语"转染（transf iz ieren) "、" 转染（Transf ection) "、" 转化 (transformieren) "或"转化（Transformation) "同义使用，并且根据本发明意指将异源核 酸（DNA/RNA)引入进真核细胞，特别是酵母细胞。
[0023] 根据本发明，抗体片段被理解为意指优选的单克隆抗体的功能部分，诸如Fc、Fab、 Fab'、Fv、F(ab'）2、 SCFv。根据本发明，相应的生物活性片段被理解为意指能够结合抗原的 那些抗体部分，诸如Fab、Fab'、Fv、F (ab'）2和scFv。
[0024] 根据本发明，Fc结合结构域被理解为意指分子或分子的部分，优选蛋白或多肽，其 能够共价或非共价结合抗体的Fc部分或其区域。根据本发明，Fc结合结构域优选非共价 结合抗体或免疫球蛋白的Fc部分。
[0025] 本申请中呈现的用于酵母细胞上的非共价表面呈递的方法已经成功地用于 VHH-Fc蛋白和IgG分子的表面呈递。ZZ结构域和Fc部分之间的非共价相互作用的稳定性 保证足够稳定的基因型-表型偶联，并且以这种方式使得能够将所述方法用于在不同混 合物内富集目标细胞。所述方法的将来用途在于，例如，在蛋白工程领域中筛选IgG分子或 多种Fc融合蛋白的文库用于鉴定具有期望特性的蛋白。使用已知含有满足期望的功能要 求的变体的文库包含在此处是有利的。由于所述方法在表面呈递过程中可以描绘VHH结构 域的亲和力的甚至微小的差异，所以该方法特别适合于抗体的亲和力成熟与随后的可溶性 生产和生物物理表征。
[0026] 为了简化所述方法，使用可以尝试使用替代锚定蛋白用于表面呈递ZZ结构域，因 为作为结果，所述使用不再限于使用酵母菌株EBY100。来自酿酒酵母的许多细胞壁蛋白原 则上适合于表面呈递异源蛋白。文献中为此描述了许多实施例 93' "。使用不同的锚定蛋白 使得可能独立选择表达菌株，因为不再必须使用具有Agal表达盒的染色体整合的菌株，诸 如EBY100。这额外打开了生成和使用适合于异源蛋白的特定需求的表达菌株的可能性。
[0027] 根据本发明的质粒构建显示于图36至39。这些通常只提供质粒和质粒构建的实 例或优选实例，并且可以由本领域技术人员在任何时间替换为其它或其变体，只要采用本 发明必需的相应的DNA序列且启动期望的功能。
[0028] 此外，以稳定方式将ZZ结构域整合至酵母基因组中以使得可能更灵活选择标记 用于可溶性分泌和更容易生成分子文库也可以证明是有利的。为了增加分泌效率，进一步 菌株操作是可建议的，因为氧化还原酶roi的过表达没有导致期望的蛋白产率。参与分泌 的进一步ER-定位蛋白（诸如，例如，Erolp)的过表达对于实现期望的蛋白产率可能是必 要的。
[0029] 金昔色葡萄球菌蛋白A 在细菌的表面上，尤其发现存在可以以高亲和力结合免疫球蛋白的蛋白61。它们在其 就宿主物种和它们可以结合的免疫球蛋白种类而言的特异性方面不同。细菌的主要致病性 代表为葡萄球菌属和链球菌属。表面蛋白的生物功能包含用蛋白固有的蛋白掩蔽细菌细 胞，以便逃避宿主的免疫系统62。最好的已知免疫球蛋白结合细菌表面蛋白之一是被称为 SpA的金黄色葡萄球菌蛋白A。其用于生物技术中用于IgG分子和Fc融合蛋白的亲和纯 化，且由五个结构域构成，所有五个结构域都有助于IgG结合，且也仍单独具有IgG结合特 性 63。IgG分子的结合主要经由Fc部分发生。此外已经证明了 SpA与Fab片段的结合64。 SpA的结构域结构显示于图I65。除了高序列同源性的五个结构域（E、D、A、B和E)以外，还 存在两个进一步结构域（X和M)(其介导细菌细胞壁中SpA的锚定）和N末端信号肽（SP) (其将SpA导航至细胞壁）。SpA与Fc部分的结合是pH依赖的 61。最强的结合存在于8的 pH66。如已经提到，结构域E、D、A、B和E也可以单独地介导Fc部分和Fab片段的结合。作 为结果，出现了尤其就这些结构域的生物技术用途而言的优点。由于与SpA相比更小的尺 寸，与SpA相比简化了单个结构域的重组产生。人工结构域衍生自结构域B且在1987年由 Nilsson和同事通过在位置29的氨基酸取代而生成 67。其就是所谓的Z结构域，并且表现 出增加的化学稳定性。此外，Z结构域与Fab片段的结合的损失通过提到的氨基酸取代实 现。作为结果，Z结构域排他地经由Fc部分结合IgG分子 68。如结构域B，Z结构域还采取 三个a _螺旋的结构69, 7°。通过使用重复的Z序列（ZZ结构域），ZZ结构域与Z结构域相 比实现对于Fc部分的更强的结合。ZZ结构域是二价分子，这意味着由于亲合力作用导致的 与单价Z结构域相比加剧了 Fc结合71。
[0030] 酵母细朐h的表而呈涕 酵母细胞的表面上的蛋白和肽文库的暴露用作蛋白的定向进化的技术，并且在文献中 被称为"酵母表面呈递"。该技术由Boder和Wittrup在1997年建立92。他们首次成功地 在酵母细胞的表面上功能呈递组合文库的scFv片段，通过流式细胞术筛选它们，并且分离 对于抗原具有增加亲和力的scFv片段 92。基因型和表型的稳定偶联使其变得可能，因为 scFv片段被呈递为具有酵母固有的细胞壁蛋白的融合蛋白。据推测，通过使用基于酵母的 呈递技术实现的最重要成就是荧光激活的细胞分选（FACS)的直接适用性，这在有效筛选 大变体文库中是决定性的。稳定的基因型-表型偶联通过异源蛋白与酿酒酵母的外细胞 壁的蛋白的融合来实现。由此实现的蛋白暴露是与抗原相互作用的前提条件。许多不同的 细胞壁蛋白原则上能够将异源蛋白和肽作为融合伴侣暴露，例如a -凝集素和a-凝集素、 Cwplp和Flolp93,94。所有这些蛋白中，a-凝集素系统尤其变得确立。该系统目前用于从未 免疫、免疫的和合成的抗体文库选择抗体。在2003年，Feldhaus和同事证明从在酿酒酵母 的表面上呈递的未免疫的人变体文库选择高亲和力的scFv变体 95。也可能通过酵母细胞 上的Fab片段的表面呈递成功地证明抗体片段的亲和力成熟96。下面部分更详细地解释了 Boder和Wittrup在1997年建立的用于借助a-凝集素在酵母细胞上表面呈递的系统。
[0031]a-凝集素系统 凝集素是酿酒酵母的外细胞壁的配对类型特异性粘附蛋白，且介导在这些细胞与 dipolide接合子融合过程中的互补配对类型的单倍体酵母细胞之间的细胞-细胞粘附。该 过程在文献中被称为接合。具有配对类型a的酵母细胞表达a-凝集素，且具有配对类型a 的酵母细胞表达a -凝集素97。细胞壁蛋白a-凝集素由亚单位Agalp和Aga2p建立。亚 单位Agalp具有GPI锚定信号，并且通过0-葡聚糖的共价结合介导蛋白固定