色体整合和氧化还原酶PDI的过表达的pRS306整合载体。
[0081] 下列实施例说明本发明，而非限制它。具体而言，如果对于本领域技术人员可容易 地可能，则可以概括单个具体实施方案、物理、生物或化学参数或材料。 实施例
[0082] (A)使用的材料、细胞和培养基 ⑴伸用的酵母菌株: EBY100 ：i?ra ^3-52trplleu2MA 200pep4\\HISiprblM.mcanlGAL(pIU211:CSMJ)。"/east KectorZzY"的部分，Invitrogen, Germany BJ5464 ：i?7a ^3-52trplleu2MA 200pep4\\HISiprblM.mcanlGAL(ATCC No. 208288) EBY100 挪f:通过 5-F0A 选择生成。Biochemie, AK Prof. Kolmar, TU Darmstadt, Germany BJ5464-挪f:通过 5-F0A 选择生成，Merck Serono，Merck KGaA，Germany AP0-E: EBY100-應_和载体 pRS306-PDI 的整合 AP0-B: BJ5464-應-和载体 pRS306-PDI 的整合。
[0083] (ii)用于培养酵母细朐的营养培养基 Yro培养基：20 g右旋糖 20 g蛋白胨 10 g酵母提取物 将组分溶解在无菌水中，添加10 ml PenStr印混合物，并且用无菌水将混合物加满至 1 1。无菌过滤后，将培养基在4°C储存最多两个月。对于琼脂板，将1.5%琼脂添加至培养 基，并且将培养基在121°C高压灭菌20分钟。
[0084] (iii)含有葡萄糖的SD培养基+ PEG8000: 将26. 7 g基础混合物（最小SD基质）溶解在490 ml无菌水中，并且将溶液在121 °C 高压灭菌15分钟。将期望的DO混合物分别与5. 4 g似2即04和8. 56 g NaH2P04 X 4〇溶 解在100 ml无菌水中，并且将溶液同样在121°C高压灭菌15分钟。在进一步批次中，将110 g PEG8000溶解在400 ml无菌水中，同时搅拌。将所有组分混合，添加10 ml PenStr印混 合物，并且将混合物无菌过滤。将其在室温储存最长四周。
[0085] (iv)含有半乳糖的SD培养基： 对于Gall启动子的诱导，使用37g含有半乳糖的基础混合物（最小SD基质(ClontechlaboratoriesInc.)，而不是26.7g/1基础混合物（最小SD基质）。将基础 混合物溶解在890ml无菌水中，并且将溶液在121°C高压灭菌15分钟。将期望的D0混合 物分别与5. 4gNa2HP〇dP8. 56gNaH2P04XH20溶解在100ml无菌水中，并且将溶液同 样在121°C高压灭菌15分钟。两种溶液已经冷却后，将基质和DO混合物组合，并且添加10 mlPenStrep混合物。将培养基在室温储存最长四周。
[0086] (v)含有半乳糖的SD培养基+ PEG8000: 将37g基础混合物（廣A5Z樓游溶解在490ml无菌水中，并且将溶液在121°C高压灭菌15分钟。将期望的D0混合物分别与5. 4gNa2HP0#8. 56gNaH2P04X H20溶解在100ml无菌水中，并且将溶液同样在121°C高压灭菌15分钟。在进一步批次中， 将110gPEG8000溶解在400ml无菌水中，同时搅拌，并且将溶液添加至高压灭菌的培养 基。完全混合所有组分后，将该批次无菌过滤，并且添加10mlPenStrep混合物。将培养 基在室温储存最长四周。
[0087] 为了选择具有附加体编码的G418抗性的转化体，将150 mg/1 Genetecin添加至 含有半乳糖的SD培养基+ PEG8000。
[0088]实施例1:用于在酵母细朐h的非共价表而呈涕的方法的制各。
[0089] 本工作的目的是开发用于在酵母细胞上非共价表面呈递IgG分子和Fc融合蛋白 和相关选择和随后所选蛋白可切换分泌至表达培养的培养基用于其生化表征的方法。用于 在酵母细胞上非共价表面呈递的方法通过衍生自蛋白A和共价锚定在细胞表面上的Fc结 合结构域的相互作用和VHH-Fc融合蛋白或IgG分子的共表达来实现。VHH-Fc融合蛋白可 溶性分泌至培养上清液通过表达条件的改变来实现。作为结果，对于可溶性生产所选克隆 (例如，在相当选择方法，诸如在噬菌体上的表面呈递 136或作为共价Aga2p融合体表面呈 递92中）必需的费时的表达质粒的格式化步骤是非必要的。为了验证该方法，使用VHH-Fc 融合蛋白，以便与使用全IgG分子相比降低实验的复杂性，由于VHH-Fc融合体是与IgG分 子对比不是由四条链、但仅由两条链构成的蛋白（图4)。在此处显示的结果的第一部分， 证明了酵母菌株的生成，所述酵母菌株过表达roi (蛋白二硫键异构酶），其中期望且可以 显示VHH-Fc融合蛋白的改进的可溶性分泌。然后证明VHH-Fc融合蛋白的分泌、该分泌的 优化和由酵母分泌的VHH-Fc融合蛋白的表征，以检查它们的功能性。下面证明了在酵母细 胞上衍生自蛋白A的Fc结合结构域的表面呈递和与可溶性分泌的VHH-Fc融合蛋白的共表 达及其表面呈递。在这种情况下，Fc结合结构域通过与Fc部分的相互作用充当VHH-Fc融 合蛋白的非共价表面呈递的介体分子。此外，分析酵母细胞的表面上的Fc结合结构域的呈 递行为和其就人IgG分子的结合而言的功能性。为了使得可能借助高通量方法使用非共价 方法从生成的变体文库分离具有期望特性的克隆，提前在混合实验的帮助下验证基因型-表型偶联的稳定性。为了实验测试且为了研宄VHH-Fc融合蛋白的这种非共价表面呈递的 基因型-表型偶联，然后证明两个混合实验和三个生成的基于VHH的文库的生产和表征以 及针对具有新特性的VHH变体筛选这些文库之一的结果。
[0090]实施例2:讨表汰PDI的酵母菌株的牛成 氧化还原酶roi (蛋0二奋穿鍵异/?)是催化底物蛋白中的二硫键的氧化和还原的ER 定位酶137。已经发表的研宄中已经证明，该酶的过表达导致scFv片段从酵母的分泌增加 118。Rakestraw和同事在2009年显示，PDI的过表达导致从酵母细胞分泌的IgG的量的显 著增加，并且PDI表达盒整合至酵母基因组中对于roi的附加体表达用于增加异源蛋白的 分泌是优选的 m。下面呈现酿酒酵母菌株AP0-E的生成的结果。据预先推测，PDI过表达 增加VHH-Fc融合蛋白的酵母菌株的分泌输出。该酵母菌株通过PDI表达盒染色体整合至 EBY100的基因组中而生成。酿酒酵母菌株AP0-B的生产以相当的方式实施（数据未显示）。 在这种情况下，PDI表达盒以相同的方式染色体整合至菌株BJ5464中。为了扩增酵母固有 的氧化还原酶，染色体DNA从在稳定条件下生长的EBY100培养物中提取。借助缺口修复 PCR和使用寡脱氧核糖核苷酸和/然后扩增具有目标载体 的同源区域的PDI的序列。1 yl染色体DNA制剂充当PCR的基质。然后借助同源重组将 基因序列克隆至目标载体中。为了起始同源重组，用限制性内切酶通 〇1将目标载体预先线 性化。电感受态EBY100 细胞用目标载体和PDI基因序列的PCR产物转化。酵母菌株 EBY100 挪T由 Stefan Zielonka (Biochemistry, TU Darmstadt, AK Prof. Kolmar)好 心提供。对于该菌株，通过5-氟-乳清酸选择预先突变营养缺陷型标记在借助测序 检查克隆后，在第二克隆步骤中，生成载体的诱导型启动子Gall/10取代为 组成型表达启动子GAPDH，以便产生载体份-/W。为了该目的，来自质粒 (Life Technologies Corp.)的GAPDH启动子的DNA序列使用寡脱氧核糖核苷酸似/%7-印 和似历77扩增，并且载体使用限制性内切酶fciAPI线性化且纯化。其后， 实施用线性化目标载体和GAPDH PCR产物转化电感受态EBY100 细胞，用于借助在酵母 细胞中的同源重组而克隆。在选择已经发生且更新测序后，电感受态EBY100细胞用 质粒似/?转化。PDI的附加体表达然后借助Western印迹分析检查（图 4)。为了该目的，50 ml培养物在合适的含有葡萄糖的SD培养基中生长。初始细胞密度为 3 X 106个细胞/ml。从该培养物开始，然后在含有半乳糖的培养基中制备进一步培养物 (50 ml)，以便检查在含有半乳糖的培养基中额外的基因表达。将两种培养物在30°C培养 至3 X 107个细胞/ml的细胞密度，其后在定义时间点移取2 X 10 7个细胞，并且处理用 于Western印迹分析。Western印迹分析的图示显示于图5,并且代表氧化还原酶的 胞内含量。特异性检测使用来自小鼠的PDI特异性抗体实施。然后PVDF膜上的检测使用 来自山羊的小鼠特异性抗体（POD缀合物）实施。图5中显示的Western印迹分析表明，附 加体编码的PDI在含有葡萄糖的培养基（图5泳道2)和含有半乳糖的培养基（图5泳道 3至7)两者中表达，并且可以经由PDI特异性检测抗体在细胞裂解物中检测它。该发现归 因于通过组成型表达GAPDH启动子调控PDI表达。与阴性对照（EBY100 __细胞，图5泳 道1)相比，在Western印迹中记录显著更强的信号。在下一步骤中证明过表达PDI的菌株 AP0-E的生成。为了产生AP0-E，将包含GAPDH启动子的序列和PDI的序列的表达盒整 合至EBY 100的酵母基因组中。为了该目的，将PDI表达盒的序列克隆至整合载体/7/?幻你 (ATCC)中。此外，限制性内切酶通〇1和油al的识别位点借助PCR连接至表达盒。使用寡 脱氧核糖核苷酸狀和通纯化PCR产物后，实施PCR产物和目标载 体/7/P5加碰]核酸内切限制化。随后使用T4-DNA连接酶将目标载体冰幻你与切割的表达 盒（pGAPDH-PDI)连接，且转化化学感受态大肠杆菌T0P10细胞。通过使五个克隆生长、分 离它们的质粒和测序，可以鉴定具有正确序列的克隆这用于将PDI表达盒 整合至EBY100的基因组中。为了准备染色体整合，如所述实施载体的制备质 粒分离。其后，质粒的线性化使用限制性内切酶实施，2.5呢线性化载体然后用于转 化EBY100 __细胞，并且作为结果，使得roi表达盒特异性整合至酵母基因组中成为可能。 在SD-URA琼脂板上的选择已经发生后，借助Western印迹分析实验研宄载体/ 的染色体整合。为了该目的，将六个克隆在YH)培养基中培养，然后转移至合适的含有半乳 糖的SD培养基。四天后，在每种情况下，移取2 X 107个细胞，且在常规条件下制备用于借 助Western印迹分析PDI表达。其结果显示在图6中。通过特异性检测六种酵母培养物的 细胞裂解物中的氧化还原酶roi (图6)，可以证实roi的成功过表达（图6泳道2-4)。用 AP0-E克隆相比，EBY100菌株的样品在Western印迹中显示显著较弱的信号（图6泳道1)。 该发现表明载体/成功整合至菌株EBY100邵4_的基因组中，并且证明氧化还原 酶PDI在该菌株中比菌株EBY100中更大程度地表达。总之，对于PDI表达盒的稳定的染色 体整合，用于选择的URA3标记借助5-氟-乳清酸突变。下面证明菌株AP0-E就VHH-Fc融 合蛋白的分泌而言的直接适用性。
[0091]实施例3: VHH-Fc融合蛋白的分泌 在本部分中，呈现VHH-Fc融合蛋白从酵母细胞的可溶性分泌的结果，以便检查酿酒 酵母菌株EBY100和AP0-E对于VHH-Fc融合蛋白的分泌输出。因为VHH是单链结构域， 因此实验设置的复杂性与使用完整的多链IgG分子相比得到降低。除了单个菌株的分 泌输出，还研宄基因剂量对蛋白的分泌量的影响。为了此目的，使用具有不同的复制起 点（Oris)并且在酵母细胞中经由同源重组预先生成的表达质粒。为了该目的，该VHH-Fc 构建体的DNA序列用来自质粒咖77-/^的特异性寡脱氧核糖核苷酸进 行扩增，并且克隆至线性化载体中。作为结果，生成具有2-micron Ori的载体 咖77-/^。具有Ori CEN6/ARS4的质粒的特征在于细胞内的低拷贝数， 且具有Ori 2-micron的质粒的特征在于细胞内的高拷贝数。开始时，电感受态AP0-E和 EBY100 细胞用质粒 咖7/-/^和 咖77-/^转化，用于 hsEGFR-特异性VHH-Fc融合蛋白的可溶性分泌。除了 VHH基因序列以外，两种质粒还编码用 于可溶性分泌的信号肽app8。对于表达，使用添加11 % (w/v) PEG8000和不添加PEG8000 的合适的含有半乳糖的SD培养基，以便额外确定PEG8000对培养上清液中VHH-Fc融合蛋 白的分泌量的影响。据预先推测，添加PEG8000可以对异源蛋白的分泌具有有益效果，因为 文献中已经指出，PEG可以对异源蛋白的分泌具有积极影响 14°。在给定时间点（24、48、96 小时），移取培养上清液的样品，并且上清液中含有的蛋白借助三氯乙酸沉淀。细胞裂解物 的样品处理以相应的方式实施。VHH-Fc融合蛋白的标记在PVDF膜上经由来自兔的Fc-特 异性一抗和来自山羊的POD缀合的兔特异性二抗实施。结果显示在图7中。在两种构建 体中，在位置297的Fc部分中的糖基化位点预先借助位点特异性诱变进行突变，以便防止 N-糖基化过程中从酵母已知的高甘露糖基化。为了该目的，该位置的诱变借助PCR和使用 寡脱氧核糖核苷酸实施。从其希望酵母促进且改善分泌蛋白。图7 A显示通 过在不添加PEG8000的情况下培养EBY100转化体而成功表达VHH-Fc构建体和可溶性分 泌。24小时后在细胞裂解物中特异性检测到蛋白（泳道1)，并且96小时后在培养上清液 中特异性检测到蛋白（泳道2)。分析的上清液的体积（泳道2)对应于5 X 107个细胞的 等效体积。在其中发现（非还原）单体形式（~40 kD)的VHH-Fc蛋白，并且仅在96小时的 表达时间后发现（非还原）二聚体形式（~90 kD)的VHH-Fc蛋白。在细胞裂解物中同样 检测到两个VHH-Fc-特异性条带（图7泳道1)。具有较低分子量的条带可以被指定为单 体的VHH-Fc蛋白（~40 kD)，因为它们具有38 kD和49 kD之间的大小。在序列分析程序 Laser职(DNASTAR Inc.)的辅助下，对于单体的VHH-Fc融合蛋白预先测定39. 6 kD的 分子量。第二个条带具有稍高的分子量（图7泳道1)。在其中VHH-Fc融合蛋白的加工没 有发生的情况下预期该较大蛋白形式，因为信号肽app8具有8. 7 kD的大小，并且在细胞信 号肽酶未处理的情况下，VHH-Fc融合蛋白的分子大小在Western印迹中明显增加。下图8 显示蛋白的未处理（图8A)和处理（图8 B)形式的图。24和48小时后AP0-E转化体的培 养上清液的Western印迹分析的结果显示于图7 B。绘制的培养体积是等于1 X 107个细 胞的体积。在这种情况下，分析与图7A泳道2相比五分之一量的细胞的上清液。图7 B额 外显示VHH-Fc融合蛋白分泌至CEN6/ARS4质粒的培养上清液（泳道3和5)和2-micron质 粒的培养上清液（泳道4和6)之间的比较。两种质粒的基因表达在相同条件下实施。与 图7 A相比，基因表达过程中细胞的培养在11 % (w/v) PEG8000存在的情况下实施。在图 4. 5 C中，已经借助Western印迹分析与B相关的细胞裂解物。如可以看到，可以在培养上 清液中成功地检测CEN6/ARS4质粒编码的VHH-Fc融合蛋白（图7 B，泳道3)和2-micron 质粒编码的VHH-Fc融合蛋白（图6 B，泳道4)。与没有PEG8000的情况下的培养（数据未 显示）相比，24小时后已经检测到明显的信号。这表明在PEG8000存在的情况下蛋白的更 多分泌。此外，在等培养体积中用2-micron质粒的培养物中发现显著较低量的蛋白，因为 检测到较弱条带信号（参照图7B泳道3和5与泳道4和6)。在细胞裂解物的分析（图7 C)中，变得明显的是，可以仅在2-micron培养物的细胞裂解物中检测到VHH-Fc-特异性信 号（泳道8)。该发现表明，与当使用CEN6/ARS4质粒时相比，使用2-micron质粒的蛋白分 泌效率较低，尽管基因剂量较高。条带信号具有对应于未加工形式的大小的分子量（图8)。 研宄的来自CEN6/ARS4培养物的细胞裂解物的样品显示既不在24小时、也不在48小时的 VHH-Fc-特异性信号。此处不再能够细胞内检测VHH-Fc蛋白，这表明该蛋白的有效分泌。 可以证实，VHH-Fc融合蛋白的表达和可溶性分泌在11 % (w/v) PEG8000存在的情况下比在 不含PEG的培养基中递送显著较高的蛋白产率。使用CEN6/ARS4质粒，同样可以相比于当使 用2-micron质粒时分泌和检测显著较大量的蛋白。在没有PEG8000的表达的情况下，可以 细胞内检测两种形式的不同大小的蛋白；一种较大的未加工形式和一种较小的加工形式。 在来自用CEN6/ARS4质粒的含有PEG8000的表达培养物的细胞裂解物的分析中，两种细胞 内蛋白形式无一被检测到，而在具有2-micron质粒的含有PEG8000的表达培养物的细胞裂 解物中，观察到未加工的蛋白形式的存在。为了进一步分析聚乙二醇（特别是PEG8000)对 VHH-Fc融合蛋白的可溶性分泌的影响，在每种情况下从咖77-/^ APO-E