和EBY100转化体开始，制备三种不同的表达培养物，其唯有其PEG含量不同（无PEG，11 % (w/v) PEG8000和11 % (w/v) PEG1500)。目的是实验研宄使用的PEG的分子量对分泌蛋 白的量是否具有影响。在含有半乳糖的SD培养基中的表达结束后，移取对应于1 X 107个 细胞的培养体积，并且在离心后，制备无细胞上清液用于Western印迹分析。这在还原条件 下实施。膜上的VHH-Fc蛋白的检测如上所述经由Fc-特异性检测抗体实施。Western印迹 分析的结果显示于图9。图9表明，聚乙二醇的添加对于培养上清液中的VHH-Fc融合蛋白 的成功分泌是决定性的。这适用于EBY100和APO-E表达培养物两者。在不添加PEG的情 况下，两种菌株的培养上清液中没有检测到任何蛋白（泳道1和4)。在该实验中，在分析的 培养上清液的体积中的蛋白的成功分泌仅在PEG8000或PEG1500存在的情况下在48小时 内是可能的。此外，使用的PEG的分子量对位于上清液中的蛋白的量具有显著影响。另一 方面，过表达PDI的酵母菌株的使用不那么具有决定性。来自图9的结果得出以下结论：与 添加具有1，500 Da的分子量的PEG相比，高分子量PEG8000对于VHH-Fc融合蛋白可溶性 分泌至培养上清液中是更合适的。基于上述结果，在所有进一步实验中，将PEG8000添加至 培养基用于分泌VHH-Fc融合蛋白。下面呈现从APO-E和EBY100表达培养物分泌的蛋白量 的更精确定量和相应地PDI过表达对培养上清液中的可溶性蛋白产率的影响。
[0092]实施例4:培养h.清液中的VHH-Fc蛋白的宙量 此处呈现的结果证明酵母菌株AP0-E和EBY100的分泌输出的实验分析。如已经提到， 据推测，氧化还原酶PDI的过表达对VHH-Fc融合蛋白的可溶性分泌具有积极影响。为了该 目的，电感受态EBY100和AP0-E细胞用质粒转化，并且在选择性 琼脂板上选择。在含有半乳糖的培养基+ PEG8000中制备50 ml表达培养物。初始细胞密 度为1 X 107个细胞/ ml。经120小时的期间，测定培养上清液中的蛋白浓度。上清液的 分析如所述借助生物层干涉测量法使用蛋白A生物传感器实施。经该期间测定的浓度呈现 在图10中的图上。将2% BSA添加至含有半乳糖的SD培养基+ PEG8000作为阴性对照， HEK293表达的已知浓度的VHH-Fc融合蛋白用作阳性对照。为了计算蛋白浓度，预先用该蛋 白编辑校准系列。可以经120小时的期间检测两种培养物中的VHH-Fc融合蛋白（图10)。 观察的倾向是，与EBY100培养物的上清液中相比，经该期间在AP0-E表达培养物的上清液 中测量到较高的蛋白浓度。96小时后，在AP0-E培养物中测量到最高蛋白浓度（1.9 ± 0.2 mg/1)。直至该时间点，蛋白浓度不断上升，此后下降至0.7 ± 0.1 mg/1 (120小时）。在 EBY100表达培养物中，与AP0-E表达培养物相比，经该期间实现显著较低的测量值。此处在 72小时后实际上已经测量到最高蛋白浓度，但与AP0-E相比值显著较低（1.2 ± 0.2 mg/ 1)。尽管如此，这低于72小时的AP0-E培养物的蛋白浓度（参见1.8 ± 0.2 mg/1)。72小 时后，蛋白浓度已经开始再次下降。120小时后，测量0.5 ± 0.1 mg/1的浓度。96小时后 EBY100的蛋白浓度与AP0-E表达培养物的蛋白浓度的比较使得清楚的是，AP0-E表达培养 物的上清液中的VHH-Fc蛋白浓度几乎是EBY100表达培养物的上清液中的VHH-Fc浓度的 两倍。此外观察到，在72小时的培养时间后，EBY100上清液中的蛋白浓度已经达到最大值。 实施进一步实验，作为用于定量酵母培养物的上清液中的VHH-Fc蛋白浓度的对照。待验证 借助生物层干涉测量（八重RED)检测的来自图10的信号是否是VHH-Fc-特异性信号，因 为在该原始值的分析过程中，观察到PEG8000对测量具有干扰效果。用于在PEG8000存在 和PEG8000不存在的情况下定量IgG分子的两种测量概况例如显示于图11。与使用PBS中 存在的用于上样的IgG分子（图11B)相比，在PEG8000存在的情况下实现的蛋白A生物传 感器的上样的较低层厚度（图11 A)是显著的。此外，在PEG8000存在的情况下，观察到测 定值的显著噪声和信号的延迟增加。图11说明PEG8000对生物层干涉测量的影响。由于 PEG8000的添加，培养基的粘度大大增加。在用IgG分子上样生物传感器的过程中观察到明 显干扰，其本身显现图11 A中与图11 B相比传感器信号的延迟和非均匀增加。对于检查 生物层干涉测量值的目的，制备具有20 ml的体积的三个独立的表达培养物，并且借助生物 层干涉测量0测定培养上清液中的蛋白浓度。为了检查信号的特异性，基于这些值，计算 对应于定义的VHH-Fc蛋白浓度的培养物体积。TCA沉淀上清液中的蛋白后，然后在Western 印迹中，经由用Fc-特异性抗体的特异性检测，研宄该培养体积。对于生物层干涉测量，再 次实施培养，持续120小时。实验开始时的细胞密度为5 X 106个细胞/ml。此时，过表达 PDI的两种酿酒酵母菌株AP0-E和AP0-B用于VHH-Fc蛋白的可溶性分泌，并且培养上清液 中的蛋白浓度在给定时间点借助生物层干涉测量进行测定。通过与预先编译的校准系列比 较，从原始值计算蛋白浓度。48、72、96和120小时后进行测量。测定的浓度呈现于图中，其 显示可以经由与蛋白A生物传感器的相互作用从所有表达培养物中的48小时的表达持续 时间检测VHH-Fc融合蛋白，并且可以测定每种培养物的蛋白浓度。为了验证测量，计算120 小时后每种培养物的培养体积，其含有2 y g的蛋白理论量。然后借助Western印迹分析这 些样品。如果八重测量的信号应当已经通过测量误差出现，这可以例如通过使用高粘度的 含有PEG8000的培养基发生，这种情况应当反映在Western印迹分析中。计算量的培养上 清液通过离心从酵母细胞中分离出，并且蛋白借助TCA沉淀，然后制备用于借助LDS-PAGE 和Western印迹分析。PVDF膜上的VHH-Fc蛋白的标记通过与来自兔的Fc-特异性一抗和 来自山羊的兔特异性二抗（POD-缀合的）相互作用实施。LDS-PAGE和Western印迹分析的 结果呈现于图13。从图13可以看到，在所有样品中借助LDS-PAGE和Western印迹分析成 功检测到VHH-Fc融合蛋白。在Western印迹分析的情况下，借助Fc-特异性检测抗体实施 检测。由于目视估算的膜上的条带的信号强度是几乎均匀的，假设来自各表达培养物的近 似相同量的蛋白用于LDS-PAGE和Western印迹分析。由于从预先实施的生物层干涉测量 计算用于LDS-PAGE和Western印迹分析的蛋白的量，因此证实生物层干涉测量的信号。假 设借助生物层干涉测量实现的测量值由于VHH-Fc融合蛋白与生物传感器表面的蛋白A的 特异性相互作用而产生，并且PEG8000对测量结果没有任何干扰影响。
[0093] 实施例5:可溶性VHH-Fc分泌和亲和层析 在进一步实验中，VHH-Fc融合蛋白以较大规模生产，然后借助蛋白A亲和层析从培养 上清液纯化。额外地实施菌株AP0-E和AP0-B的分泌输出的进一步比较。其后，研宄纯化 蛋白就与特定抗原（hsEGRF)的相互作用的功能性，因为从文献中已知由酵母表达的蛋白 通常被高糖基化 141。为了该目的，电感受态AP0-E和AP0-B细胞用用于可溶性分泌VHH-Fc 融合蛋白的质粒转化，并且在选择性琼脂板上选择。从预培养 开始，表达培养物用200 ml的体积接种。VHH-Fc融合蛋白的分泌在11 % (w/v) PEG8000 存在的情况下实施96小时，因为已经证明，该培养时间对于VHH-Fc融合蛋白的分泌是有利 的。表达结束后，留下约185 ml的培养物容积。通过离心从培养上清液分离酵母细胞。然 后将蛋白酶抑制剂（PIC III) (1:1，000)添加至上清液，以便减少培养基中蛋白酶对蛋白 的降解，并且将混合物转移至免透析管（MW 10 kD) (Thermo Scientific GmbH)。 培养上清液的透析如上所述实施。透析结束后，将各个渗析管的内容物组合，并且用于借助 蛋白A HiTrap 1 ml柱（GE Healthcare Europe GmbH)亲和层析纯化VHH-Fc融合蛋白。透 析结束后的体积为约400 ml。由于体积大幅增加，观察到培养上清液的粘度降低。然而，由 于某些残余粘度仍然存在，所以假设PEG8000没有完全从上清液中去除。粘度的降低相应 地更归因于培养上清液的稀释，而非含有PEG8000的培养基更换为PBS。层析的纯化和筛选 (图14 A)结束后，将各个相关洗脱级分组合。缓冲液更换为pbs在ro-io柱的帮助下实 施。其后，各20 y 1部分借助LDS-PAGE进行分析。结果呈现于（图14 B和C)中。图14 中呈现的结果显示借助蛋白A亲和层析从AP0-E和AP0-B表达培养物的上清液成功地纯化 VHH-Fc融合蛋白。借助LDS-PAGE对纯化蛋白的分析显示足够的纯度（图14 B和C)。在 层析（图14 A)中，在应用样品过程中吸收的增加在两种样品中是可检测的。对于AP0-E， 最大吸收在113. 1 mAu检测到，对于AP0-B，最大吸收在42. 2 mAu检测到。在AP0-E上清 液的情况下，吸收升高至AP0-B上清液中实现的值的几乎两倍的值。在应用样品的过程中， 用AP0-E (图15泳道4)和用AP0-B样品（数据未显示）借助Western印迹分析在流通液 (Durchbruch)中都没有检测到VHH-Fc蛋白。因此，可以假设VHH-Fc蛋白完全结合至柱。 在从柱洗脱蛋白的过程中，在两种样品中都检测到明显区分的峰，延伸7 ml (AP0-E)和17 ml (AP0-B)。缓冲液交换的级分的分析借助LDS-PAGE实施。通过目视比较AP0-E和AP0-B 的信号强度（参照图12 B和C)，可证实AP0-E的级分与AP0-B相比蛋白量显著较大。借 助NanoDrop在合并级分中测定280 nm的波长的蛋白浓度（并入分子量和消光系数）。最 后，借助蛋白A亲和层析，从200 ml AP0-E表达培养物分离0. 34 mg VHH-Fc融合蛋白，并 且从200 ml AP0-B表达培养物分离0.1 mg VHH-Fc融合蛋白。下面呈现由AP0-E表达的 蛋白的功能性的分析。
[0094]实施例6:由酵母产牛的VHH-Fc融合蛋白的功能件分析 从AP0-E培养物的上清液纯化VHH-Fc融合蛋白后，检查蛋白的功能性。因为从文献 中已知酿酒酵母高糖基化某些肽序列141且其可以对蛋白的稳定性、分泌和生化特性具有影 响，所以实验研宄VHH-Fc蛋白与抗原hsEGFR的结合特性。为了该目的，hsEGFR相互作用的 动力学测量借助生物层干涉测量使用蛋白A生物传感器来进行。在实验之前，已知VHH结 构域对于抗原hsEGFR具有高特异性和亲和力。为了该目的，将纯化的VHH-Fc融合蛋白固 定在蛋白A生物传感器的表面上（图16 A，步骤1)。借助蛋白A亲和层析预先纯化的蛋白 用于此。在进一步批次中，VHH-Fc表达培养物的培养上清液用于负载蛋白A生物传感器。 洗涤步骤（图16 A，步骤2)后，实施PBS中的基线的测量（图16A，步骤3)。如果使用培 养上清液，则实施两个洗涤步骤（图16 B，步骤2和3)，因为其含有PEG8000。然后实施与 ?85中的可溶性抗原1^￡6?1?(25〇11]\1、125 11]\1、62.5 11]\1和15.6 11]\〇的结合（图164，步骤4; 图16 B，步骤5)。在PBS中实施VHH-Fc融合蛋白和hsEGFR的解离（图16A，步骤5 ;图16 B，步骤6)。分析hsEGFR特异性VHH结构域与mmEGFR和hs-cMet的结合作为对照，VHH结 构域对于其没有特异性。在这种情况下，预期与抗原mmEGFR和hs-cMet没有任何生物分子 相互作用。测量的结果显示于图16。用纯化的蛋白和含有蛋白的培养上清液，蛋白A生物 传感器的成功负载都是可能的。负载通过前600秒中信号的连续增加来检测（图16 A和 B，步骤1)。因为能够以与培养上清液中存在的蛋白高非常多的浓度采用纯化蛋白用于负 载生物传感器，所以传感器信号在这种情况下以显著较大增加而上升，并且可以在更大的 程度负载传感器。实现了 3.1至3.5 nm的层厚度。用培养上清液负载传感器实现了平均 0. 2 nm的较小层厚度（图16 B)。在随后的洗涤步骤过程中的传感器信号的水平进程表明 了稳定的负载（图16A步骤2至3 B步骤2至4)。在图16 B中看到负载和第一洗涤步骤 之间的信号的清晰跳跃。该发现归因于通过将来自培养基（+ PEG8000)的传感器浸入PBS 中引起的缓冲液的改变。图16 A中看不到该跳跃，因为用于负载的蛋白已经作为PBS中的 溶液存在。用VHH-Fc负载的传感器上可溶性hsEGFR的结合显示于步骤4(图16 A)和步 骤5(图16B)中。在结合过程中，传感器信号的显著增加在两种情况下都发生。这种增加 代表hsEGFR与用VHH-Fc负载的传感器表面的特异性结合。为了分析VHH-Fc和hsEGFR之 间的相互作用的动力学常数，进行实验数据的统计学拟合（图17)。动力学常数在表4. 1中 给出。
[0095] 表4.I: VHH-Fc和hsEGFR之间的结合的动力学常数。
【主权项】
1. 通过表达、分泌和将其呈递在酵母细胞的表面上而产生多种抗体、生物活性抗体片 段或具有特定特性的抗体结构域的方法，其包括以下步骤： (a) 提供酵母种酿酒酵母（ceiwisiae)的宿主细胞，其已经用合适质 粒的形式的第一和第二核酸分子转染，其中所述第一核酸分子编码融合蛋白，所述融合蛋 白基本上包含细胞表面锚定蛋白、Fc结合结构域和可调节启动子，所述可调节启动子根据 培养条件控制所述融合蛋白的表达，并且所述第二核酸分子编码所述抗体群体，所述抗体 片段或抗体结构域呈其轻链和重链的形式，并且在永久活性启动子的控制下， (b) 通过在培养基中存在具有> 5, 000的分子量的聚乙二醇（PEG)的情况下在酵母细 胞中同时共表达多种抗体、抗体片段或抗体结构域而表达所述融合蛋白，其中所述免疫球 蛋白分子以及融合蛋白以可溶性形式从酵母细胞分泌， (c) 在所述酵母细胞的表面上呈递多种抗体、抗体片段或抗体结构域，其以非共价形 式结合至表达的锚定至细胞表面的融合蛋白的Fc结合结构域， (d) 根据结合至Fc结合结构域的多种抗体、生物活性抗体片段或抗体结构域的期望 的不同的表型或结合特性，在结合至融合蛋白或免疫球蛋白分子或其中含有的检测标记的 帮助下选择和分离酵母细胞， (e) 在使得可能不或基本不进一步表达融合蛋白的培养条件下在特定选择的酵母细 胞群体中表达多种抗体、生物活性抗体片段或抗体结构域，和 (f) 从培养基分离具有所选表型或结合特性的多种抗体。
2. 根据权利要求1的方法，其中所述细胞表面锚定蛋白是a-凝集素或a -凝集素。
3. 根据权利要求1或2的方法，其中所述融合蛋白包含aga2p和Fc结合结构域。
4. 根据权利要求3的方法，其中所述Fc结合结构域是蛋白A ZZ结构域。
5. 根据权利要求4的方法，其中表达且分泌在细胞表面的融合蛋白包含aga2p和蛋白 A ZZ结构域，并且结合至结合且呈递在细胞表面的agalp亚单位。
6. 根据权利要求5的方法，其中GALl启动子用于从ZZ结构域和aga2p表达融合蛋白。
7. 根据权利要求5或6的方法，其中GAPDH启动子组成型用于表达抗体、抗体片段或抗 体结构域。
8. 根据权利要求1-7中任一项的方法，其中使用PEG8000或更高分子量PEG。
9. 根据权利要求1-8中任一项的方法，其中所述抗体片段或抗体结构域包含Fab片段 或VHH结构域。
10. 根据权利要求9的方法，其中所述VHH结构域是VHH-Fc融合蛋白。
11. 根据权利要求1-10中任一项的方法，其中使用酵母菌株EBY100。
12. 根据权利要求1-11中任一项的方法，其中分开的质粒用于第一和第二核酸分子。
13. 根据权利要求12的方法，其中pYDl用作起始质粒。
14. 根据权利要求1-13中任一项的方法，其用于产生用于生成和选择具有所选表型或 结合特性的整个抗体、Fab片段或其它生物活性抗体结构域的抗体文库。
【专利摘要】本发明涉及用于在酿酒酵母细胞的表面上产生和非共价表面呈递抗体和衍生片段以及基于其的分子文库的方法。表面呈递的非共价方式使得可能借助高通量筛选选择特定变体和随后所选结合分子可切换分泌至培养上清液用于生化表征。
【IPC分类】C07K16-00
【公开号】CN104870471
【申请号】CN201380069362
【发明人】R.京特, B.霍克, S.贝克, L.里尔
【申请人】默克专利股份公司
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2013年12月11日
【公告号】CA2896908A1, WO2014106527A1