在细胞壁的 细胞外基质98。亚单位Aga2p同样由细胞分泌，并且经由两个二硫键键合至Agalp。为了使 用a-凝集素系统暴露异源蛋白，待呈递的蛋白通常被克隆至相应的表达载体作为与亚单 位Aga2p的C末端融合体92。诱导基因表达后翻译且在表面上呈递的重组构建体以图示形 式显示于图2中。(Agalp)由染色体整合的半乳糖诱导型表达盒表达。由Agalp和 Aga2p的结合，异源蛋白在酵母细胞的表面上共价暴露，并且可以在其结合特性的帮助下或 借助亲和表位通过流式细胞术检测（图2)。对于在本工作过程中多种蛋白的表达、分泌和 表面呈递，〃/?切7 /eaW Kector （Invitrogen)可商业获得。
[0032] 作为表汰系统的酿酒酵母 已经在各种宿主生物体中成功地生产重组蛋白。这些包括原核表达系统，诸如大肠杆 菌1(1°，还有真核表达系统，诸如哺乳动物细胞1(11。酿酒酵母同样适合于表达异源蛋白，也因 为它是最佳表征的真核宿主生物体，其从1996年基因组测序以来已经特别用作用于研宄 真核细胞功能的模式生物体 1(12' 1(13。作为单细胞生物体，它与其他真核系统相比不那么复 杂，且其在确定培养基中的培养是可能的，作为其结果，生长条件的良好控制和培养成本的 显著降低是可能的 1M。具有约90分钟的生成时间的相对短生命周期是酵母酿酒酵母的优 选用途的进一步原因1(12。作为单细胞生物体，酵母组合了微生物表达系统由于简单培养和 使用工业发酵方法导致的优点以及真核表达系统由于真核表达和细胞中的分泌途径的存 在导致的优点。此外，酵母载体的大规模选择是可用的，这使得可能遗传操作 1(15。与其它酵 母（诸如例如巴斯德毕赤酵母）相比，酿酒酵母通常归因于较低分泌效率，由于所述原因， 其作为用于生产异源蛋白的宿主生物体在工业上经常不是有利的 1(16。下面部分显示酵母酿 酒酵母作为用于表达异源抗体分子的宿主生物体的重要性。
[0033] 酿酒酵母中的抗体表汰 对于例如借助免疫沉淀、ELISA或生物层干涉测量的生化和生物物理特性，必需产生足 够量的重组蛋白。实现可溶性抗体或抗体片段的足够产量的大量生产系统目前已经存在。 这些表达系统是例如哺乳动物细胞，裂殖酵母巴斯德毕赤酵母，昆虫细胞或大肠杆菌 1(|h°9。 酿酒酵母中的抗体表达已经长时间证明是不那么适合的，因为产率经常太低无法用于进一 步使用。对于IgG分子，实现仅50 yg/1的产率n°。通过进化方法，Rakestraw和同事在 2009年成功地显著增加了来自酿酒酵母的scFv片段和IgG分子的分泌。通过筛选变体文 库的信号肽MF a lp，鉴定了使来自酿酒酵母的scFv片段的分泌与野生型序列相比增加16 倍的突变体m。使用相同方法与酵母菌株的操作的组合，甚至可能使功能性IgG分子的分 泌增加180倍 m。该发现证明用于酵母细胞中的异源蛋白的分泌的信号肽的相关性。该情 况在工业过程中尤其重要，其中足量分泌对于随后的过程步骤的简化是重要的 1(1。合适的 酵母菌株的选择也是决定性的。通过表达菌株的基因操作，可以增加用于表达异源抗体分 子的菌株的分泌输出。在这方面，与酵母的分泌途径相关的蛋白是重要的。这些是例如酶 诸如氧化还原酶(蛋白二硫键异构酶）（其参与二硫键的还原和氧化），和HSP70分子 伴侣，诸如BiP(免疫球蛋白结合蛋白）（其参与分泌蛋白的折叠） 112。据推测，BiP结合内 质网（ER)中的未成熟蛋白，并且以这种方式防止聚集体的形成。通过突变体分析，可显示 BiP的耗竭导致未成熟蛋白的聚集且其停留在ER中 113。由此然后随后通常诱导UPR(未折 叠的蛋白应答）114和借助ERAD(ER相关的蛋白降解）蛋白水解降解蛋白 115,阻断蛋白合成 和活化编码分子伴侣的基因116。可以得出结论，ER的质量控制的机制是酵母细胞中异源蛋 白的可溶性分泌的最关键瓶颈之一 117。通过过表达折叠助剂诸如PDI和BiP，可以显示可 以使酿酒酵母中的scFv片段的分泌增加十倍 1(16' 118。尽管如此，在文献中指出，无论待分泌 的蛋白，来自PDI和BiP的过表达的益处大大取决于特定蛋白的特性，并且存在无法得益于 PDI和BiP的过表达的蛋白1(16' 119。由于真核生物酵母特别适合于生产异源人蛋白，所以加 工和分泌遵循蛋白表达的真核机制。这些机制包括翻译后加工，诸如折叠、糖基化和磷酸化 115。蛋白的表达、ER中的折叠和分泌经受严格的质量控制，其具有正确折叠和功能性蛋白可 以从酵母表达培养物中分离的效果。
[0034] Fc结合结构域的表而呈涕 本工作的目的是建立和尝试用于在酵母细胞上非共价表面呈递Fc融合蛋白和IgG分 子的方法。与酵母细胞上的共价表面呈递92相反，在此处呈现的方法中，待呈递的蛋白经由 Fc结合ZZ结构域的其Fc部分被锚定在细胞表面上。为了该目的，ZZ结构域作为Aga2p融 合蛋白被共价锚定在细胞表面上。通过ZZ结构域的表达的调节，表面呈递和可溶性分泌之 间存在选择性切换的可能性。由于ZZ结构域和Fc部分之间的相互作用是可逆和pH依赖 的 67,该系统必须满足稳定的基因型-表型偶联的需求，这是该系统成功用作选择方法的 先决条件。来自金黄色葡萄球菌的蛋白A(SpA)以高亲和力结合至多种IgG分子的Fc部分。 SpA由五个结构域（A、B、C、D和E)组成，所述结构域也可以单独结合Fc部分 63。结构域B 的折叠是所有SpA结构域的实例。其由两个反向平行的a螺旋和一个稍扭曲的第三个a 螺旋组成。然而，由于已经显示共结晶实验，螺旋3不直接参与Fc结合 64。本工作中使用 的Fc结合结构域是衍生自结构域B的Z结构域，且已知也以高亲和力结合人抗体分子的Fc 部分149。Z结构域在1987年由Nilsson和同事通过在结构域B中的人工氨基酸取代（位 置29的甘氨酸取代为丙氨酸）而生成，并且显示与结构域B相比改善的稳定性 67。此外， 作为重复Z序列的ZZ结构域用于本工作中。根据文献，其归因于与Z结构域相比显著增加 的对于Fc部分的亲和力 144' 15°。在本工作中，可以通过与细胞壁蛋白Aga2p的融合在酵母 细胞上共价呈递Z和ZZ结构域两者。两个结构域的正确折叠在FACS中通过结合IgG分子 (西妥昔单抗）和随后添加荧光标记的抗原（b-hsEGFR)和SA-PE进行检测。如预期，结果 显示，ZZ结构域对于Fc部分的亲和力比Z结构域更高，因为呈递ZZ的细胞的更强烈荧光标 记在相同的条件下是可能的。该发现可以通过亲合力效应来解释，因为ZZ结构域是二价分 子，而Z结构域是单价的 67。Fc部分中存在两个潜在的SpA的结合位点，在每种情况下每条 重链一个位点。这也是为什么SpA与IgG的化学计量结合比率为1:2的比率的原因 63。蛋 白A具有五结构域结构，然而，其在功能上是二价的151_153。四个SpA结构域对于Fc的高亲 和力的同时结合解释了几个单独SpA结构域的组合中的表观亲和力的增加 68' 144。假设ZZ 结构域达到Fc部分上的两个结合位点，这也将解释ZZ结构域相比于Z结构域与Fc的更强 结合的发现 144' 15°。尽管如此，存在迹象表明Fc部分上的两个结合位点的同时结合的先决 条件是破坏该结构域的a螺旋结构，作为其结果，Fc结合将不再可能 7°。因此宁可假设二 价构建体的一个Z结构域介导与Fc的结合，而没有参与结合的Z结构域通过与结合的Z结 构域或第二结合位点的弱相互作用介导亲合力效应，并且导致降低的U 1' 144,因为通过一 个Z结构域的解离，使得另一个Z结构域的结合是可能的。这也解释了以下事实，即Z和ZZ 结构域对于结合Fc具有相似的亲和力常数 144。在本工作中，与单价Z结构域相比，对于二 价ZZ结构域测量了通过用IgG分子标记的更强的荧光信号。该发现据推测不是由细胞上 的较大量的IgG分子的捕获引起，因为ZZ结构域，像Z结构域也结合仅一个IgG分子。在 两种情况下，因此存在1:1的比率。出于该原因，据推测，仅ZZ结构域与Fc的更强结合导 致荧光强度的增加。与此处呈现的工作的主题相关，已经证明，Z结构域可用于在大肠杆菌 细胞154, 155和病毒156, 157上固定抗体。呈递ZZ的酵母细胞也已经充当免疫吸附剂用于从血 清样品检测抗体158。此外，已经可以在酵母细胞的表面上呈递ZZ结构域作为a凝集素融 合体，并且通过与分泌Fc-EGFP的细胞共培养而用荧光标记它们 159。
[0035]VHH-Fc融合蛋白的表而呈涕 也还可以用内源分泌的VHH-Fc融合蛋白进一步标记呈递ZZ的细胞，用于通过外部添 加IgG分子（西妥昔单抗）进行标记。从而证明该方法用于非共价表面呈递VHH-Fc融合 蛋白的能力。为了该目的，在细胞中共表达VHH-Fc和ZZ。通过Fc部分与ZZ结构域的结 合，可溶性分泌的VHH-Fc融合蛋白被捕获在细胞上，并且经由添加抗原影响标记。在这种 情况下，在FACS中检测与用西妥昔单抗标记相比显著降低的荧光强度，这表明用内源分泌 的VHH-Fc对ZZ结构域的更低效的标记。该发现还表明，用VHH-Fc没有饱和在细胞表面上 呈递的ZZ结构域，且存在仍然游离的ZZ结构域。一个原因可以是VHH-Fc蛋白与ZZ结构 域相比更低效的分泌或两种蛋白的分泌的不平衡。两种基因（ZZ和VHH-Fc)的表达通过 Gall启动子调节。因此对于所述两种基因可以预期类似高表达水平。然而，酿酒酵母中外 来基因的表达的限制步骤是已知的。此处可以参考例如以下事实，即使用相同的启动子，酵 母固有的基因在比外来基因更大的程度表达 141。该情况的原因是密码子使用对翻译延伸的 影响。尽管存在遗传密码的冗余性，某些密码子在翻译过程中是优选的，因为不是所有tRNA 和氨酰基-RNA都以相同方式存在。此外，密码子使用在各种生物体之间明显不同 141。在本 工作中，VHH-Fc融合体的序列就酿酒酵母的密码子使用而言没有优化，并且因此代表翻译 过程中可能的问题。因此可以解释为什么VHH-Fc分泌降低。可以推测两种蛋白的不同分 泌的进一步原因是翻译后的。与VHH-Fc融合蛋白相比，ZZ结构域是小蛋白，其有效功能性 折叠和分泌，而没有二硫键。由于其良好的分泌和折叠特性，ZZ结构域经常作为与显示不 良分泌的蛋白的融合体产生。另一方面，VHH-Fc融合蛋白的折叠需要正确形成位于铰链区 中的至少三个二硫键。下面部分中解释正确二硫键桥接对于VHH-Fc融合蛋白的成功可溶 性分泌的重要性。为了该目的，将过表达roi(蛋白二硫键异构酶）的酵母菌株（AP0-E)的 分泌输出与不过表达roi的菌株EBY100进行比较。
[0036]VHH-Fc融合蛋白的分泌 为了改善VHH-Fc融合蛋白的分泌，产生两种酵母菌株。通过遗传操作，与这些菌株 (AP0-E和AP0-B)来源的酵母菌株（EBY100和BJ5464)相比，在这些菌株（AP0-E和AP0-B) 中实现了位于ER的氧化还原酶PDI的组成型过表达。对于菌株AP0-E，在VHH-Fc表达培养 物的上清液中测量到与起始菌株EBY100相比高一倍的蛋白浓度。该发现证实了已经公开 的结果，即PDI表达对蛋白的可溶性分泌具有有益效果 162。已知PDI在酵母细胞的ER中蛋 白的折叠过程中催化二硫键的氧化和还原。这是细胞的分泌途径中的决定性步骤，因为二 硫键的正确形成对于蛋白（诸如例如此处使用的VHH-Fc融合蛋白）的结构稳定性是关键 的。细胞内的质量控制机制确保只有正确折萱的蛋白分泌。错误折萱的蛋白暴露例如疏水 氨基酸区域，从而导致UPR(未折叠的蛋白反应）的诱导。这些蛋白然后由进一步的位于ER 的分子伴侣（诸如例如BiP)结合，后者随后不导致分泌，但还导致借助ERAD(ER相关的降 解）降解蛋白 115。在本工作中，PDI的过表达据推测促进VHH-Fc蛋白的正确折叠，作为其 结果，可以分泌较大量的蛋白，因为胞内区中存在较高含量的正确折叠的蛋白。然而，文献 中已经显示通过roi的过表达的分泌的显著更大和更有效的增加m。Rakestraw和同事显 示通过使用过表达PDI的酵母菌株和分泌序列app8的整个IgG分子的分泌的180倍增加 m。在本工作中没有实现该分泌效率，甚至在与分泌序列 app组合的情况下。通过roi的 过表达改善的分泌据推测取决于分泌的特定蛋白117,阐明其它分子伴侣的表达是否可导致 VHH-Fc分泌的进一步增加是适当的。此外，已知PDI从同样位于ER的酶Erolp从头获取二 硫键，然后它将其直接用于氧化底物蛋白中的二硫键 163。以这种方式看，Erolp负责PDI的 再循环，因为它将PDI从还原状态转化成氧化状态。由于该原因，在与PDI相同的程度上过 表达Erolp据推测是有利的。通过Erolp和的平衡表达水平，可以再次更迅速地氧化 还原的PDI分子，以便氧化底物蛋白中的新二硫键。
[0037] VHH-Fc融合蛋白的表而呈涕和分泌的优化 除了 PDI的过表达以外，进一步因子还显示对改善VHH-Fc融合蛋白的可溶性分泌及其 表面呈递的影响。因此下面讨论表达条件对表面呈递和分泌的影响和基因剂量对分泌的影 响。在实验工作开始时，市售的合成基本培养基（Clontech)用于培养和表面呈递。这些培 养基具有略微酸性pH (pH 5. 8)，并且呈非缓冲的形式。在合成的基本培养基中培养酵母细 胞的过程中，观察到进一步酸化，这据推测由酵母分泌的代谢产物引起。类似于此，在过夜 培养物中测量到约3的pH (数据未显示）。这些培养基的使用证明针对pH依赖的ZZ:Fc 相互作用的背景是不利的，因为通过降低pH，ZZ结构域与Fc部分的结合变得较弱 164。使 用这些培养基，不可能检测VHH-Fc的表面呈递，因为根据文献，Z结构域和Fc部分的相互 作用在pH 3. 3后不再存在67。通过随后使用缓冲的基本培养基（pH7.0)，在足够长的培养 期稳定PH，并且使得ZZ结构域和VHH-Fc之间的结合是可能的。在这种情况下，可以经由 与抗原的相互作用标记细胞上的VHH-Fc融合蛋白，并且作为结果，在FACS中检测它。然 而，测量与阴性对照相比仅略微增加的荧光强度。此外，荧光强度比在用外部添加的IgG 标记呈递ZZ的细胞的情况下低40倍。如已经提到，这表明VHH-Fc融合体的低效表达或 VHH-Fc融合蛋白的低效分泌。该假设得到以下情况的支持：ZZ结构域在同时以显著更高 的效率呈递在细胞表面上，并且因此未占用许多ZZ结构域，因为可以用蛋白A特异性检测 抗体在显著更大的程度上在细胞表面上标记ZZ结构域。仅通过将11 % (w/v) PEG8000添 加至培养基来实现VHH-Fc融合蛋白的表面呈递的荧光信号的显著强化。然而，在有和没有 PEG添加的情况下，ZZ结构域的荧光信号是恒定强度的。可以从其得出结论，PEG8000对 VHH-Fc融合蛋白的分泌具有积极影响。下面讨论的进一步实验证实了该假设。在有和没 有PEG8000的情况下VHH-Fc表达培养物的上清液的分析显示，添加PEG8000非常更有效地 分泌VHH-Fc融合蛋白，因为在培养基中检测到显著较高的蛋白浓度。VHH-Fc融合蛋白分 泌至培养基中需要蛋白经由细胞膜的细胞内转运。酿酒酵母中蛋白的常规分泌途径翻译时 和/或翻译后导入内质网，从那里进入高尔基体，并且经由转运囊泡从其开始到细胞膜。细 胞外分泌然后借助通过转运囊泡与细胞膜的融合的胞外分泌和将囊泡内容物排放至培养 上清液中发生。PEG8000可以促进与细胞膜的囊泡融合，并且以这种方式改善VHH-Fc融合 蛋白的分泌。已经显示，PEG导致膜通透性的增加，且改变膜组分的流动特性 166。这可以由 PEG与脂质双层的直接相互作用和所得的其不稳定而发生。出于该原因，PEG也经常用于杂 交瘤生产过程中的细胞融合，并且通常被称为"融合剂" 167。然而，PEG的影响也可以具有间 接性质，因为它影响周围水性培养基的极性特性，并且作为结果，导致膜稳定性的降低。该 效果可以通过周围培养基中的高度亲水的PEG对脂质双层的极性头部基团的脱水来解释 168。此处只可推测PEG改善的VHH-Fc分泌的精确机制。有趣的是，分泌效率大大取决于 使用的PEG的分子量。与用PEG1500相比，用高分子量PEG8000在培养基中检测到显著更 大量的蛋白。使用的PEG的分子量据推测与PEG与细胞膜的可能相互作用直接相关。Uma Maheswar Rao和Satyanarayana同样说明PEG的分子量对分泌的影响。他们显示与较低分 子量的PEG相比，在PEG8000存在的情况下a淀粉酶从高温烷烃地芽孢杆菌 从的改善分泌 14°。除了已经描述的分泌增加和从而引起的细胞表面上的 ZZ结构域的更高占有率以外，在PEG8000存在的情况下表面呈递的VHH-Fc融合蛋白的更 强荧光信号也可以额外进一步通过由于培养基的粘度增加导致的ZZ结构域的Fc部分的解 离降低来解释。在这种情况下，解离的VHH-Fc融合蛋白的扩散由于培养基的高粘度而降 低，且ZZ和Fc的关联得到促进。在含有PEG8000的培养基中培养过程中实现的细胞密度 表明，PEG对培养物的生长特性不具有显著影响，尽管计算到由于培养基的高粘度导致的氧 气进入的降低。尽管如此，在有和没有PEG的情况下实现了培养过程中相当高的细胞密度 (数据未显示）。酵母细胞内的VHH-Fc基因剂量尤其取决于质粒的拷贝数。预期由于质粒 拷贝数增加导致的VHH-Fc融合蛋白的合成率增加。因为在到目前为止讨论的结果中使用 通过细胞中的低拷贝数区分的基于CEN6/ARS4的质粒，推测使用基于2-micron的质粒可 导致VHH-Fc融合