择性切换。与经由ZZ结构域的表面呈递相反，这种方法不限于待呈递的蛋 白的Fc部分的存在。相反，表面呈递经由蛋白的体内生物素化和细胞表面与生物素和抗生 物素蛋白的化学缀合使得成为可能。对于可溶性产生，仅仅省略细胞的化学缀合。然而，该 系统需要蛋白的修饰，这在用ZZ结构域的表面呈递的情况下是不必要的。针对IgG分子的 表面呈递的背景，因此最终形式的抗体的表面呈递使用本工作中呈现的非共价方法是可能 的。作为结果，可以排除通过蛋白的人工修饰的抗体特性的结构相关的损害。
[0042]【附图说明】： 图1:金昔色葡萄球菌SdA和SdA衍牛的结构域的示意图 蛋白A (SpA)的结构域结构显示于⑷中。这由五个IgG结合结构域（E、D、A、B、E)、 信号序列（SP)和用于在细菌细胞壁中锚定SpA的两个结构域（X和M)建立。（切显示衍生 自B结构域和通过重组DNA技术获得的人工Z结构域。ZZ结构域通过Z序列的复制产生 (根据 Bostr5m，T.，Nilvebrant，J.，Honer，S. 201261 改良）〇
[0043]图2:根据Boder和Wittrup的酵母细胞上的表面呈递.。
[0044]图3:用于在酵母细朐h的非共价表而呈涕和可溶件牛产的方法的示意图 细胞上共价锚定的Fc结合结构域以绿色显示。（切可溶性分泌的VHH-Fc融合蛋 白通过Fc结合结构域被捕获在细胞表面上。通过抑制Fc结合结构域的表达，VHH-Fc 融合蛋白可溶性分泌至培养基中，并且不再捕获在细胞表面上。
[0045]图4: IgG分子和VHH-Fc融合蛋白之间的比较的图 完整IgG分子（左）和VHH-Fc融合蛋白（右）之间的结构比较的图。两种蛋白是同 源二聚体，IgG分子由两条相同的抗体轻链和两条相同的抗体重链构成，而VHH-Fc融合蛋 白仅由两条相同的链构成。
[0046]图5:酵母会田胞中的附加体PDI表达的Western￡P迹分析 2 X 107个EBY100邵^细胞转化体）的Western印迹分析。 检测经由来自小鼠的PDI特异性一抗和来自山羊的小鼠特异性二抗（P0D缀合物）实施。泳 道1显示EBY100 __ (阴性对照）中的细胞内PDI含量。泳道2至7显示在各个时间点 通过由GAPDH启动子调节的附加体编码PDI序列的额外过表达的细胞内PDI含量（参见图 注）。
[0047]图6:酵母会田胞中的染芦,体PDI表达的Western￡P迹分析 在含有半乳糖的SD培养基中培养四天的EBY100 (泳道1)和AP0-E (泳道2-4)培养物 的细胞裂解物（2 X 107个细胞）的还原条件下的Western印迹分析。检测经由来自小鼠 的PDI特异性一抗和来自山羊的小鼠特异性二抗（P0D缀合物）实施。
[0048]图7:可溶件VHH-Fc分泌的分析 来自用不同表达条件的EBY100和AP0-E培养物的培养上清液和细胞裂解物的Western 印迹分析。在没有添加PEG8000的情况下96小时后VHH-Fc (CEN6/ARS4)表达的细胞 裂解物（1 X 107个细胞，泳道1)和培养上清液（5 X 10 7个细胞，泳道2)的分析。你」 24小时和48小时后在添加PEG8000的情况下VHH-Fc表达的培养上清液的分析。使用的表 达质粒是ARS4/CEN6质粒（泳道3)和2-micron质粒（泳道4和6)。显示与（B)关联 的细胞裂解物。检测经由Fc特异性一抗（兔）和P0D缀合的兔特异性二抗（山羊）实施。 CL :细胞裂解物，CS :培养上清液。
[0049]图8: VHH-Fc融合蛋白的加工 VHH-Fc融合蛋白的细胞内状态的示意图。未加工的蛋白（A)在细胞内作为较大形式 (48. 4 kD)存在，因为信号肽app8(8. 7 kD)没有被切掉，而成熟蛋白（B)具有39. 6 kD的分 子量。箭头标记细胞内信号肽酶的识别位点。
[0050] 图9:聚乙二醇对VHH-Fc融合蛋白的分泌的影晌 48小时后的VHH-Fc分泌。EBY100和AP0-E培养上清液的Western印迹分析，用于分 析聚乙二醇（PEG)对培养上清液中可检测的蛋白的量的影响。不同组成的表达培养基。泳 道 1和 4:不添加 PEG，泳道 2 和 5:11 % (w/v) PEG8000,泳道 3 和 6:11 % (w/v) PEG1500。
[0051] 图10:来自AP0-E和EBY100表汰培养物的VHH-Fc分泌产率 生物层干涉测量法用于测定经120小时期间EBY100和AP0-E表达培养物的上清液中 的VHH-Fc融合蛋白的浓度。误差条代表三次独立测量。
[0052] 图11:有和没有添加PEG的情况下的牛物层干涉测量概况的实例 使用SD培养基+ 11 % (w/v) PEG8000 (A)中和PBS (无PEG8000)(B)中的可溶性蛋 白用IgG分子负载蛋白A生物传感器的生物层干涉测量概况的实例。有色曲线代表用于负 载蛋白A生物传感器的各种IgG浓度。以渐降顺序，25、10、5、2、l、0.5、0.1、0mg/l。
[0053] 图12:来自AP0-E和AP0-B表汰培养物的VHH-Fc分泌产率 借助蛋白A生物传感器经120小时期间生物层干涉测量测定AP0-E和AP0-B表达培养 物的上清液中的VHH-Fc融合蛋白的浓度。误差条代表三次独立克隆。
[0054] 图13:来自AP0-E和APO-B VHH-Fc表汰培养物的培养h清液的LDS-PAGE和 Western￡P迹分析 来自三种独立表达培养物的VHH-Fc融合蛋白（培养上清液）的还原条件下的 LDS-PAGE，其用考马斯染色。2 yg抗体西妥昔单抗用作对照（+)。（切来自（A)的样品的 Western印迹分析。经由Fc特异性一抗（兔）和兔特异性的P0D缀合的二抗（山羊）的检 测。1 yg西妥昔单抗用作对照（+)。
[0055] 图14:借助蛋白A亲和层析纯化VHH-Fc融合蛋白 (A)针对PBS透析后借助来自AP0-E (红色）和AP0-B (黑色）200 ml表达培养物的 VHH-Fc的蛋白A HiTrap柱的亲和层析纯化的层析图。将1 ml来自（A)的洗脱峰的级分 合并，并且借助ro-10柱在PBS中再缓冲。连续线代表吸光度（mAu)，虚线代表导电率（mS/ cm)。（B)和（C)显示借助LDS-PAGE (非还原）分析的ro-10柱的洗脱级分（各500 y 1)。
[0056]图15: VHH-Fc融合蛋白的纯化的分析 来自200 ml AP0-E培养物的上清液的VHH-Fc蛋白表达和纯化的Western印迹分析 (还原）。HEK293产生的VHH-Fc融合蛋白用作阳性对照。在纯化过程的各个时间点分析融 合蛋白的样品（参见图注）。
[0057] 图16: VHH-Fc和hsEGFR的相互作用的分析-牛物层干涉测量概况（原始数据） 在hsEGFR上纯化的VHH-Fc融合蛋白（A)和来自上清液的VHH-Fc (B)的生物层干涉 测量概况的原始数据。显示八个蛋白A生物传感器的测量概况。（1)用VHH-Fc负载蛋白A 生物传感器600秒。（A 2至3):洗涤步骤，（B 2至4):洗涤步骤，（A 4, B 5)结合，（A 5， B 6):解离。
[0058] 图17: VHH-Fc和hsEGFR的结合分析（经处理数据） VHH-Fc和hsEGFR的生物分子相互作用的动力学表征。显示经处理的传感图。在固定 在传感器表面上的VHH-Fc融合蛋白上的hsEGFR的结合（1)和解离（2)。PBS中的纯化的 VHH-Fc蛋白（A)和培养上清液中的VHH-Fc⑶。阴性对照：mmEGFR，你；hs-cMet。单 独绘制蛋白浓度。有色曲线显示实验测定的数据，红色曲线显示这些数据的统计学拟合。
[0059]图18: VHH-Fc糖基化分析 有（+)和没有（_) EndoH的情况下的酵母分泌的VHH-Fc蛋白的LDS-PAGE。在每种情 况下，2 yg以下蛋白在相同条件下用EndoH处理作为对照：hsEGFR(来自CH0)和硫氧还蛋 白（来自大肠杆菌）。
[0060]图19:用于Fc结合结构域的表而呈涕的克降计划 用于作为Aga2p融合蛋白表面呈递Fc结合结构域（Z和ZZ结构域）的载体的示 意图。（A)显示Aga2p盒的单个组分。Z结构域的克隆经由（A)中显示的限制性切割位点 Mel和feMlI实施。（B)显示构建体Aga2p-Z结构域。（C)显示构建体Aga2p-ZZ结构域。
[0061]图20: Z和ZZ结构域的Aga2D介导的表而呈涕 单价Z结构域（A)和二价ZZ结构域（B)在每种情况下作为Aga2p融合体的表面呈递。 Agalp是染色体编码的，且表达通过半乳糖诱导型Gall启动子（pGall)调节。Aga2p 融合体是附加体编码的和/77i?-Z2)。它们的表达同样由Gall启动子调节。Z结构 域和ZZ结构域经由甘氨酸-丝氨酸接头（Gly/Ser)结合至亚单位Aga2p的C端。
[0062]图21: EBY100细朐h的Z和ZZ结构域的流式细朐术和表而呈涕 在其表面上呈递Aga2p、Aga2p-Z和Aga2p-ZZ的EBY100细胞的流式细胞术分析。在表 达24小时（A)和表达72小时（B)后，借助来自山羊的蛋白A特异性的FITC缀合的检测抗 体实施荧光标记。另外给出构建体的平均相对荧光强度和标记区域Ml内的细胞的百分比 含量。
[0063]图22:呈涕ZZ的细朐的诱射光和荧光显微镜照片 显示呈递Aga2p-ZZ的EBY100细胞和呈递Aga2p的EBY100细胞（C)的透射光（A)和 荧光显微镜照片（B)。检测在（B)和（C)中用来自山羊的蛋白A特异性的FITC缀合的抗体 来实施。
[0064]图23: Z和ZZ结构域的IgG结合和流式细朐术 表达24小时后呈递Z和ZZ结构域的EBY100细胞和转化体）的流式 细胞术分析。用抗体西妥昔单抗（1uM)、b-hsEGFR(1yM)和SA-PE实施标记。另外显 示标记区域Ml内的平均相对荧光和细胞的百分比含量。阴性对照：Aga2p 转化体）。
[0065]图24: VHH-Fc融合蛋白的表而呈涕 表面呈递由细胞表面上共价锚定的ZZ结构域介导。细胞在（A)和（B)中用b-hsEGFR/ SA-PE标记。（A)中显示24小时后，⑶中显示72小时后，没有（-PEG)和有添加PEG8000 (+PEG)的情况下的FACS分析的结果。借助b-hsEGFR和SA-PE实施标记。（C)显示通过用 来自山羊的蛋白A特异性的FITC缀合的抗体标记检测24小时后两种培养物的ZZ结构域。
[0066]图25:呈涕VHH-Fc的细朐的诱射光和荧光显微镜分析 由ZZ结构域介导的在其表面上呈递VHH-Fc融合蛋白的EBY100细胞的荧光显微镜 照片。细胞一方面用b-hsEGFR/SA-PE (行：hsEGFR)标记，另一方面用b-rFcRn (褐家鼠 (行：大鼠FcRn)(列：PE)标记。客页外实施用Fc-特异性抗 体的进一步标记（列：Alexa 647)。两种焚光信号的重叠显不在列PE + Alexa 647中。
[0067]图26: IgG分子的非共价表面呈递 (A) 24和⑶48小时后的双色标记和流式细胞术。黄色荧光（相对荧光黄色）显示藻 红蛋白和因此b-hsEGFR的结合的信号；红色荧光（相对荧光红色）显示AlexaFluor 647? 的信号（Fc信号）。24小时：标记区域Ml内的细胞的36. 4%，48小时：标记区域Ml内的细 胞的43.4%。对照：用SA-PE标记的来自（A)的细胞。标记区域Ml内的细胞的0.2%。 (D)以高度简化形式显示通过经由Aga2p (淡蓝色）和Agalp (深蓝色）共价锚定的ZZ结构 域（绿色）的IgG分子的表面呈递。灰色箭头表明轻和重IgG链的可溶性分泌。
[0068]图27: IgG分子的共价表而呈涕 (A) 24和（B) 72小时后呈递IgG的EBY100细胞的双色标记。黄色荧光（相对荧光黄 色）显示SA-PE和因此生物素化抗原（b-hsEGFR)的结合的信号；红色荧光（相对荧光红 色）显示AlexaFluor? 647的信号（Fc特异性抗体）。（C)以高度简化形式显示在成功装 配轻和重IgG链的情况下IgG分子作为共价Aga2p融合体的理论假设表面呈递。
[0069]图28: VHH-Fc:ZZ相互作用的稳宙件的FACS分析 呈递VHH-Fc的EBY100细胞的FACS柱状图。（A)标记的VHH-Fc的表面呈递（红色） 和未标记的VHH-Fc的表面呈递（黑色）。（B)在时间T。的初始1:1混合物。（C) 32小时 后的1:1混合物。经由b-hsEGFR和SA-PE检测VHH-Fc融合蛋白。
[0070]图29:经32小时期间的VHH-Fc:ZZ相互作用 与初始测量相比各个时间点后Ml群体的平均相对荧光（* )和ZZ结构域和VHH-Fc之 间的所得百分比结合含量（）的图形表示（图26 B)。
[0071]图30:各种VHH-Fc融合蛋白和hsEGFR的结合的八重和FACS分析 借助生物层干涉测量和FACS分析三个VHH结构域（VHH-A、VHH-B、VHH-C)与抗原 (hsEGFR)的生物分子相互作用。平均荧光黄色（相对荧光黄色）再现位于FACS测量（FACS) 的Ml中的细胞的平均相对荧光强度。VHH结构域与可溶性抗原（250 nM、125 nM和62. 5 nM hsEGFR)的相互作用的结合和解离的经处理测量值显示于生物层干涉测量列中。
[0072]图31:各种VHH-Fc融合蛋白（A、B、C)与抗原hsEGFR的结合的FACS分析的图形 表示 经由与ZZ结构域的相互作用在EBY100细胞上作为Fc融合体呈递的三个VHH结构域 (VHH-A、VHH-B、VHH-C)的hsEGFR的结合的平均相对荧光信号。在每种情况下，相同数目的 细胞用各种hsEGFR浓度（200 nM至0 nM)和SA-PE标记，且通过流式细胞术分析。表面呈 递的信号的标准化后，将荧光信号针对浓度绘图。误差条代表三次独立测量。
[0073]图32:可切换的表而呈涕的FACS分析 用于研宄VHH-Fc融合蛋白的可切换分泌的FACS柱状图。⑷和似pYD-pGal-app8-VHHl-Fc/pYD-ZZ。（B)热(D)pYD-pGAPDH-app8-VHHl_Fc/pYD-ZZ。11 错取 域的检测经由来自山羊的蛋白A特异性抗体（FITC缀合物）实施。经由Fc-特异性F (ab'）2 片段（AlexaFluor? 647缀合物）检测VHH-Fc融合蛋白。灰色：在含有葡萄糖的培养基中 培养，红色：在含有半乳糖的培养基中培养。
[0074]图33:表而呈涕和可溶件牛产之间的诜择件改夺 EBY100的双色标记和流式细胞术。在含有半乳糖的培养基（+PEG8000)中培养细胞显 示于（A)中。相对荧光绿色显示ZZ结构域的表面呈递。相对荧光红色显示非共价呈递的 VHH-Fc融合蛋白的表面呈递。通过将细胞转移至含有葡萄糖的培养基（+ PEG8000) (B)，在 细胞表面上不再可检测到ZZ结构域和VHH-Fc融合蛋白（参见M1A和M1B)。
[0075]图34: VHH-Fc融合蛋白的可切换分泌的分析 VHH-Fc表达培养物的上清液中借助TCA沉淀的蛋白级分的Western印迹分析。研宄 Gall启动子和GAPDH启动子在含有半乳糖的培养基和含有葡萄糖的培养基中的行为。PVDF 膜上的VHH-Fc融合蛋白的检测经由Fc片段特异性一抗（兔）和兔特异性POD-缀合的二 抗（山羊）实施。
[0076]图35: VHHf库的克降策略 用于产生VHH文库的克隆策略的示意图。将VHH序列的突变变体（红色）经由PCR产 物的末端的同源区（重叠）并入线性化目标载体中。此处使用酵母细胞中同源重组的机制。
[0077]图36: Fc结合结构域的表而呈涕的质粒 (A)用于在EBY100细胞的表面上表面呈递Aga2p融合蛋白的质粒/?7似（Invitrogen) 和用于作为Aga2p融合体表面呈递Z结构域你;和ZZ结构域的质粒 的示意图。/77/K2Z另外还与G418抗性盒替代营养缺陷型标记Trpl存在，并且被称为 似78 (质粒图谱未显示）。
[0078]图37:用于可溶件分泌的质粒 用于可溶性分泌的质粒的示意图。所有质粒都编码用于可溶性分泌的信号肽a/7/访。 用于hsEGFR特异性VHH结构域的分泌质粒；表达为Fc融合蛋白。仞用于Trx-特 异性VHH结构域的分泌质粒；表达为Fc融合蛋白。（幻用于VHH结构域B的分泌质粒。识） 用于VHH结构域C的分泌质粒。
[0079]图38:用于I gG分子的可溶件分泌的质粒 用于通过信号肽app8介导的IgG分子马妥珠单抗的（A)重链和（B)轻链的可溶性分 泌的质粒。（C)用于作为Aga2p融合体表达马妥珠单抗的重链的质粒。
[0080]图39:用于染色体PDI整合的质粒 来自AgilentTechnologiesInc?的 pESC-URA 载体。如具有 PDI 序列的 pESC-URA载体。具有PDI序列和GAPDH启动子（PDI表达盒）的pESC-URA载体。（D) 用于PDI表达盒的染