蛋白的分泌增加。这些质粒通过细胞中高至多达100倍的拷贝数来区分 139。为了该目的，制备就其质粒拷贝数而言不同的VHH-Fc表达培养物用于可溶性分泌。有 趣的是，针对所有预期，测量到基于2-micron的质粒的较低蛋白分泌，并且基于CEN6/ARS4 的质粒的VHH-Fc基因序列的表达导致蛋白更有效分泌至培养上清液中。此外，观察到，与 CEN6/ARS4质粒相比，通过使用2-micron质粒，存在未加工的VHH-Fc融合蛋白的增加的细 胞内浓度。因为使用的前-原信号肽app8具有8.7 kD的分子量，在Western印迹分析中在 VHH-Fc融合蛋白的细胞内形式（加工和未加工的）之间进行区别。成熟的VHH-Fc融合蛋 白通过去除信号肽后的其较低分子量与未加工形式可容易区分，并且可以在细胞裂解物中 免疫检测到两种蛋白形式。只有当使用2-micron质粒时才检测到未加工的蛋白形式。该 发现表明细胞内蛋白酶对信号肽的不太有效的去除。可能增加的转录水平和所得更大量的 蛋白限制蛋白的正确加工。两种细胞内蛋白酶负责前原信号肽的去除。前区域的前19个 氨基酸由位于ER的信号肽酶切割。蛋白在ER中通过和其转运至高尔基体之后，将蛋白酶 Kex2p在晚期高尔基区室中负责去除原区域 141。原区域包含进一步64个氨基酸。可以推 测，蛋白酶Kex2p是蛋白的加工中的限制步骤，因为其去除信号肽的显著较大的原区域。通 常可以说，异源蛋白的过表达和分泌总是代表对于酵母细胞的应激状态 117。高拷贝数据推 测导致转录水平增加，因此导致酵母细胞的应激反应。分泌可能由此受到阻碍，因为通过中 间体和错误折叠的蛋白的积累，UPR机制可以由于应激的结果而被诱导。这将导致蛋白的 蛋白水解降解，而非分泌。此外，存在蛋白合成的能量和资源的限制的可能性，这尤其在大 肠杆菌中在高转录物水平观察到 169' 17°。此外，然而，如提到的蛋白的转位、信号肽的加工和 蛋白在ER中的折叠也可以对分泌具有限制作用。尽管还不可能完全阐明基因剂量增加使 分泌降低的发现，但基于CEN6/ARS4的质粒用于进一步分泌。
[0038] 由酵母产牛的VHH-Fc融合蛋白的功能件 对表面呈递过程中的细胞和培养上清液中的可溶性两者研宄VHH-Fc融合蛋白的功能 性。为了成功使用非共价方法用于选择和表征VHH-Fc融合蛋白，所述蛋白必需在细胞上和 培养上清液中呈功能形式。功能性通常由蛋白的正确糖基化和折叠决定。表面呈递的蛋 白的功能性经由特定抗原的结合进行检测。经72小时期间，细胞上的VHH-Fc融合蛋白可 通过与抗原hsEGFR的结合进行标记，并且在FACS中成功地检测。与SpA结构域A至E相 比，Z和ZZ结构域只有经由Fc部分结合IgG分子 64。对于结构域A至E，另一方面，IgG分 子具有位于Fab片段中的进一步可能的结合位点。该结合主要经由Fab片段的亲水性氨基 酸残基发生。同样显示，蛋白A结合VHH结构域的框架区 171。通过SpA或其结构域与抗体 的Fab片段或VHH结构域的相互作用，与抗原的结合竞争可发生，作为其结果，可损害抗原 结合。使用ZZ结构域用于表面呈递确保VHH-Fc融合蛋白和IgG分子的结合排他地经由Fc 部分发生，并且因此没有阻碍与抗原的结合。通过Fc部分的结合，表面呈递的蛋白的有利 对齐和暴露此外是可能的。酵母细胞具有质膜之外约200nm厚的细胞壁，其致密含有酵母 固有的细胞壁蛋白 172。通过使用Agalp-Aga2p蛋白复合物用于ZZ结构域的表面锚定，这被 足够远暴露至细胞外环境中，以便使得与例如VHH-Fc融合蛋白的结合成为可能。此外，通 过Fc部分的结合，如所提到，同源二聚的VHH-Fc融合蛋白的两个VHH结构域以进一步距离 从细胞呈递，并且暴露，使得与抗原的未阻碍的相互作用是可能的。已知短锚定蛋白（诸如 例如蛋白Flolp的缩短形式）不能充分达到进入细胞的细胞外环境，并且出于该原因，表面 呈递的蛋白无法以期望的方式检测，因为与抗原或与检测抗体的相互作用被细胞壁空间阻 碍 94。另一方面，使用延长的Flolp形式使得检测成为可能。鉴于非共价系统内VHH-Fc融 合蛋白的功能性的进一步研宄，制备表达培养物，用于VHH-Fc融合蛋白可溶性分泌至培养 上清液中。功能性经由测定蛋白和抗原hsEGFR的生物分子相互作用的动力学常数进行评 估。为了该目的，来自培养上清液的蛋白借助蛋白A亲和层析纯化，并且用于借助生物层干 涉测量的结合分析。与hsEGFR结合的动力学常数从用来自HEK293表达培养物的VHH-Fc 融合蛋白预先进行的测量是已知的（数据未显示）。对于酵母产生的蛋白和对于HEK293产 生的蛋白两者都实现了落在9 nM至90 nM的KD范围的相当测量值。因为与酵母表达相比， VHH结构域的N端Fc融合体（VHH结构域的N端上的Fc部分的C端）用于HEK293表达， 不同的K D值可以通过Fc融合体的性质来解释。VHH结构域的抗原结合经由所述结构域的 N端区域发生。形成互补位且以这种方式介导与抗原的结合的三个CDR位于其中 173。在用 于HEK293表达的基因序列中，VHH基因的5'区域与Fc部分的序列融合。可能由此引起对 抗原的亲和力的降低，这本身表现为生物层干涉测量中的较低K D值。据推测，与Fc部分的 VHH结构域的C端融合体（VHH结构域的C端上的Fc部分的N端）没有导致抗原的结合的 损害，因为对于抗原结合测量到与N端Fc融合体相比较高的K D值。该发现是貌似可信的， 因为在天然存在的重链抗体中，VHH结构域也经由其C端经由铰链区结合至Fc部分。由于 抗原结合，如提到，经由VHH结构域的N端和位于其中的CDR介导，所以这些不被损害，并且 自由地用于Fc融合体对抗原的相互作用。此处可以参考例如VHH-Fc融合体ART621 (Arana Therapeutic Ltd.)，其目前正在经历用于治疗银肩病的临床试验m。此外可在Western印 迹分析中确定，VHH-Fc融合蛋白的二聚化是成功的。Fc部分的重链的正确折叠和二硫键 的形成使得二聚化成为可能。这据推测通过在本工作开始时的Fc部分的N-糖基化位点的 诱变而得到促进。为了该目的，在位置297的氨基酸天冬酰胺（N)的密码子被取代为氨基 酸谷氨酰胺（?的密码子，并且以这种方式，防止了在蛋白的N-糖基化过程中对于啤酒糖 酵母已知的高甘露糖基化175。大量甘露糖残基另外可以在空间上阻碍Fc二聚化，作为其结 果，ER中的链间的疏水接触区域可以变得暴露。这会诱导细胞的应激反应，且导致蛋白的 分泌的损害。此外可在生物层干涉测量过程中证明Fc部分的功能性，因为蛋白A传感器可 用VHH-Fc融合蛋白成功地负载。在自然条件下，人IgG分子在位置297被糖基化。观察到 该位置的人糖基化有助于稳定CH2结构域，因此对IgG分子的Fc部分的二聚化具有积极作 用 176。
[0039] IgG分子的表而呈涕 本工作中建立的方法的多样化使用也通过整个IgG分子的成功表面呈递证明。这清楚 地表明，可成功地呈递各种抗体形式。尽管如此，与VHH-Fc融合蛋白相比，IgG分子的非共 价表面呈递在配置中更复杂，因为与VHH-Fc融合蛋白的表面呈递相比，酵母细胞用三种质 粒、而非仅两种质粒转化。除了用于表达Aga2p-ZZ融合体的质粒以外，对于轻和重抗体链 的可溶性分泌需要两种进一步质粒。为了表面呈递完整抗体，酵母细胞因此必须使得在培 养过程中稳定获得所有三种质粒成为可能。为了该目的，Agalp-ZZ质粒的选择 经由G418抗性标记和含有G418的培养基发生，以便使用EBY100菌株的营养缺陷型标记用 于选择质粒用于重和轻抗体链。ZZ结构域对抗体的成功捕获通过细胞上的Fc部分的标记 和检测而得到证明。可经由特异性抗原的结合检测IgG分子的功能性。尽管如此，不可能 可靠地检测除了重链以外是否还呈递轻链，因为在该时间点，没有合适的针对轻链的特异 性检测抗体可用。抗体重链也可介导与抗原的结合而不装配轻链，因为大多数结合通过IgG 分子的重链发生 177。尽管如此，假设轻和重IgG链的装配是成功的，因为否则抗体的较差分 泌据推测减少表面呈递。由于除了 CH1和CL之间的二硫键以外，轻链和重链的装配经由疏 水相互作用发生，重链的疏水氨基酸残基会在ER中暴露，且会诱导UPR的机制。有趣的是， 只可使用用ZZ结构域的非共价方法证明酵母细胞上的完整IgG分子的表面呈递。该发现通 过进一步实验出现，其中重链IgG链作为Aga2p融合体共价呈递在表面上，而可溶性分泌轻 链。在该实验中，可经由Fc部分的标记检测细胞表面上的重链。此外，然而，抗原结合的检 测是不成功的。对于轻链的可溶性分泌，使用Rakestraw和同事 111选择的分泌序列app8， 而重链作为与的融合体表达。信号肽的选择已知对来自酿酒酵母的异源蛋白的分泌 具有很大影响，因为信号肽确定是否分泌蛋白，在细胞中具有期望的位点或变为细胞膜的 成分。Hashimoto和同事能够显示，使用不同的信号肽导致分泌产率的显著差异 178。已经 通过基于MF a lpp信号肽的进化方法专门选择用于分泌轻链的信号肽app8用于有效分泌 蛋白m。该信号肽是83个氨基酸前原序列，与其它信号肽相比，其由用于易位进入ER的信 号肽和由高尔基体中的位于膜的蛋白酶Kex2p加工。重链，在另一方面，作为与蛋白Aga2p 的融合体分泌，所述蛋白Aga2p经由两个二硫键结合至细胞壁蛋白Agalp。成熟融合蛋白 的加工据推测在此处仅经由位于ER的信号肽影响。轻链和重链的不同加工机制可以使得 两种链的装配变得困难，使得其无法检测抗原结合。在上面对于抗体讨论的非共价表面呈 递的情况下，表达具有分泌序列app8的重链和轻链两者。在这种情况下，两种抗体链都经 受相同的加工机制，这据推测使得与抗原的功能装配和结合成为可能。Rakestraw和同事 在2009年使用SECANT?呈递技术在酵母细胞上表面呈递完整抗体 126。对于表面呈递，为 此，重链作为与生物素受体肽的融合体表达。生物素受体肽的生物素化通过共表达的生物 素连接酶BirA实施。细胞表面的化学生物素化和与抗生物素蛋白孵化后，分泌的生物素化 的抗体的呈递经由细胞上的抗生物素蛋白-生物素相互作用发生。在该设置中，表达具有 相同分泌序列（app8)的两种抗体链。他们显不完整IgG分子从酿酒酵母的分泌和IgG分 子经由生物素-抗生物素蛋白相互作用的非共价表面呈递。Sazinsky和同事在2008年显 示用于在酵母细胞上表面呈递完整IgG分子的一个进一步实例。他们经由与细胞表面上的 化学缀合的荧光素的结合呈递荧光素特异性IgG分子 179。然而，这种类型的表面呈递，与经 由ZZ结构域的非共价表面呈递相比，具有IgG分子经由与它们的抗原的结合捕获在表面上 的缺点。因此，只可以呈递具有已知和足够亲和力的蛋白。此外，对于每次选择必须生成单 独缀合的细胞表面。在提到的两种表面呈递的系统相比，在本工作中，呈递没有进一步修饰 的IgG分子，而所述蛋白固有的IgG分子的结构用于在该方法中的表面呈递。从而保证抗 体的抗原结合Fab片段被自由暴露。此外，非共价方法使得在无需进一步亚克隆的情况下 直接使用所选克隆用于可溶性分泌成为可能。尽管如此，与抗生物素蛋白和生物素之间的 结合相比，用于表面呈递的结合（ZZ:Fc相互作用）稳定性较差。
[0040]基闵塑-表塑偶联 成功使用非共价表面呈递用于选择具有修饰特性的变体只有当细胞上呈递的蛋白变 体和对于该变体的细胞内遗传信息之间存在稳定关联时才可以实现。如果该关联不存在 时，选择过程中鉴定变体是不可能的。与酵母细胞上的共价表面呈递相比 92,该方面在此处 呈现的系统中需要特别考虑，因为表面呈递是pH依赖和可逆的。已经显示，培养基的酸化 导致ZZ结构域和Fc部分之间的较差结合，并且低于3. 3的pH不再形成该结合。此外存在 蛋白变体通过ZZ结构域和Fc部分的结合的解离和结合结合至"不正确"细胞，并且假阳性 克隆的选择可以这种方式发生。ZZ: Fc相互作用的稳定性的研宄因此是本工作的中心成分。 在两种不同的混合实验中实验研宄这种相互作用。在第一混合实验中，呈递ZZ结构域的细 胞（目标细胞）经由IgG分子的结合从高过量的对照细胞浓缩。为此，将目标细胞稀释在 对照细胞的大群体中，且在三轮选择内从从最初〇. 001 %或〇. 0001 %分别浓缩至100%或 90%。目标细胞通过西妥昔单抗和荧光标记的抗原（b-hsEGFR)的相继结合来标记。100% 或90%的高浓度率显示ZZ结构域和IgG分子之间的稳定相互作用。进一步证明通常选择 方法诸如MACS和FACS的成功使用。ZZ结构域的高表达率无疑对目标细胞的标记和选择 具有积极影响。由于ZZ结构域的表达由有效的Gall启动子调控，在含有半乳糖的培养基 中诱导后，大量ZZ结构域被呈递在细胞表面上。此外，高浓度的西妥昔单抗和hsEGFR用于 标记细胞，以便使得目标细胞上的ZZ结构域的完全饱和成为可能。作为结果，目标细胞可 强烈荧光标记，且在FACS中与显示显著较低相对荧光强度的对照细胞清楚区分。甚至通过 IgG分子从细胞表面的解离和将这些分布在细胞混合物内，对照细胞不可能用可用的IgG 分子标记，因为这些没有呈递ZZ结构域。在这种情况下，仅预期与细胞表面的微弱非特异 性相互作用，这没有导致选择假阳性对照细胞。在第二混合实验中，目标细胞和对照细胞两 者都呈递ZZ结构域。目标细胞还分泌hsEGFR特异性的VHH-Fc融合蛋白，而对照细胞还分 泌非EGFR特异性的VHH-Fc融合蛋白。两种VHH-Fc融合蛋白仅应当在特定细胞群体上呈 递。目标细胞经由呈递至荧光标记的抗原（b-hsEGFR)和SA-PE的VHH-Fc融合蛋白的结合 进行标记。两种VHH-Fc融合蛋白的表面呈递的比率的测定通过特定Fc部分的标记使得成 为可能，且允许控制VHH-Fc融合蛋白的表达。这避免了导致歪曲选择条件的表达差异。制 备0. 001 %和0. 0001 %的初始稀释液。可分别通过连续三轮选择将混合物内的目标细胞浓 缩至40%和80%。在该混合实验中，与第一混合实验相反，实现了目标细胞的较低浓度率。 此外，与从初始较低稀释度（〇. 001% )相比，从初始较高稀释度（〇. 0001% )实现了目标细 胞的更大浓度。该发现是无意义的，并且据推测可以通过混合物的制备过程中或分选过程 中的误差解释，因为初始存在较少目标细胞。该混合实验显示，大多数分泌的VHH-Fc蛋白 被捕获在它们自身的细胞上，并且没有通过解离达到相邻细胞，并且变得结合在那里。然 而，由于特定含量的VHH-Fc融合蛋白尽管由于ZZ:Fc相互作用的动力学特性而从其自身ZZ 结构域解离，静态培养和由于将11 % (w/v) PEG8000添加至培养基导致的增加粘度使解离 的VHH-Fc融合蛋白的扩散最小化。由于目标细胞和对照细胞的VHH-Fc融合蛋白具有Fc部 分的相同序列，据推测，对照细胞上的VHH-Fc融合蛋白以与目标细胞的VHH-Fc融合蛋白相 同的方式从ZZ结构域解离。存在hsEGFR特异性的VHH-Fc融合蛋白（目标细胞）的特定 部分被相邻细胞上的未占用的ZZ结构域捕获的可能性。这些可位于目标细胞和对照细胞 两者上。然而，不正确捕获的VHH-Fc融合蛋白的含量可能非常低，因为ZZ结构域和Fc部 分之间存在高亲和力结合。此外，不正确捕获的VHH-Fc融合蛋白将分布在整个混合物中， 并且变得高度稀释。通过用抗原荧光标记，这些信号然后将位于低于FACS中的检测限值， 并且落在阴性对照的荧光强度的区域中。作为结果，可以排除选择假阳性细胞。为了增加 混合实验的复杂性，首先混合目标细胞和对照细胞，并且然后诱导整个细胞混合物的表面 呈递。出于该原因，可以推测，在培养用于诱导表面呈递的过程中，ZZ结构域和VHH-Fc融 合蛋白之间存在稳定结合。该程序详细代表了用于筛选分子文库的方法。酵母细胞上的非 共价表面呈递的方法因此似乎特别适合作为选择方法。
[0041]可切换的表而呈递 非共价方法与共价系统相比用于酵母细胞上的表面呈递的一个显著优点是，非共价方 法打开了表面呈递和可溶性分泌的模式之间选择性切换的可能性。这种可切换功能通过使 用不同的启动子用于表达ZZ结构域和VHH-Fc融合体而实现。为了该目的，ZZ结构域的表 达通过半乳糖诱导型和葡萄糖抑制型Gall启动子调控，而VHH-Fc融合体的表达借助GAPDH 启动子组成型发生。对于VHH-Fc融合蛋白的表面呈递，将双转化体在含有半乳糖的SG培 养基中培养。在这种情况下，ZZ结构域经由与Agalp的相互作用作为Aga2p融合体呈递在 细胞表面上，并且VHH-Fc融合蛋白可捕获在细胞上。这通过用特异性检测抗体标记和检测 ZZ结构域且通过VHH结构域的抗原结合在FACS中成功检测。为了 VHH-Fc融合蛋白可溶 性分泌至培养上清液中，将细胞转移至含有葡萄糖的SD培养基中。Gall启动子的抑制和 从而ZZ结构域的表达的抑制由于含有葡萄糖的培养基而发生 141。作为结果，VHH-Fc融合 蛋白不再可能被捕获在细胞表面上，并且其被分泌至培养基中。尽管如此，观察到，在培养 基改变之前已经呈递在细胞上的剩余ZZ结构域在转移至SD培养基后仍然被呈递（数据未 显示）。为了该目的，细胞经历另一传代，且新培养物用非常低的细胞密度接种。所述传代 大大稀释了仍呈递ZZ结构域的细胞。由于ZZ结构域的表达抑制，以下代的细胞不再显示 表面呈递。使用由Rakestraw和同事建立SECANT?呈递技术，也已经可以在表面呈递和可 溶性生产之间选