VIM ;F23 = FlagVlF23M ;V1-DSB = FlagVIMDSB ;F23-DSB = FlagVlF23MDSB。图 16A 是显示各种 VhH 的 分离的非-还原SDS-PAGE凝胶；可溶性细菌表达产生达23mg/LVhH。全部以它们的预期的 分子质量运行。图16B显示各种VhH的单-循环动力学SPR传感图。VhH保持与固定的空 肠弯曲杆菌（C. jejuni)鞭毛高亲和性结合及拟合1:1结合模型。各VhH的KD显示在传感 图上。图16C显示各种VhH的Superdex 75?尺寸排阻层析谱，展示全部是非-聚集单体， 全部样品接近1〇〇 %单体峰。
[0078]图 17 显示在中性 pH(7. 3)和酸性 pH(2. 0)，FlagVIM 和 FlagVlF23M VhH 和它 们的二硫键变体的热未折叠曲线。计算中-点未折叠温度（熔解温度，Tm)。在pH2.0， VI完全变性，及FlagVlF23M在25°C的起始温度部分变性。FlagVIMDSB在pH2. 0部分变 性，而FlagVlF23MDSB完全折叠，展示FlagVlF23M和额外二硫键对VhH热稳定性的加和效 应。开环表示复制1 ;实心圆形表示复制2。VI = FlagVIM ;F23 = FlagVlF23M ;V1-DSB = FlagVIMDSB ;F23-DSB = FlagVlF23MDSB。
[0079] 图18显示FlagVIM和FlagVlF23MVhH和它们的二硫键变体对主要胃肠蛋白酶的 蛋白酶感受性。将VhH用胃蛋白酶，胰蛋白酶和糜蛋白酶消化；在对照实验中，将VhH在酶的 缺失下温育。消化的VhH和对照由SDS-PAGE分离。条形图总结由SDS-PAGE凝胶的密度计 分析产生的蛋白酶抗性特征。为各VhH和各蛋白酶实施总共3次独立消化。误差条表示平 均蛋白酶抗性土 SEM。VI = FlagVIM ;F23 = FlagVlF23M ;V1-DSB = FlagVIMDSB ;F23-DSB =FlagVlF23MDSB。
[0080] 图19显不由VhH暴露于多蛋白酶而空肠弯曲杆囷（C. jejuni)运动性减小。图19A 是显示将VhH用胃蛋白酶之后是胰蛋白酶和糜蛋白酶连续消化的示意性模式图。图19B是 连续消化的还原SDS-PAGE凝胶分析。图19C是运动性测定的条形图总结。条表示用缓冲 剂对照，VhH或蛋白酶-消化的VhH处理的板上自3次独立实验的空肠弯曲杆菌（C. jejuni) 的平均直径；误差条表示SEM。在5mm处的虚线表示板上空肠弯曲杆菌（C. jejuni)的起始 直径。统计学分析由单因素ANOVA之后是Dunnett氏多比较测试实施，全部相对于无VhH的 对照（**P〈〇.〇l)。FlagVIM 和 FlagVlF23MVhH。
[0081] 图20描绘代表性的空肠弯曲杆菌（C. jejuni)运动性测定的结果。在功能性VhH 的存在下空肠弯曲杆菌（C. jejuni)运动性减小。将空肠弯曲杆菌（C. jejuni)株81-176 应用于含对照缓冲剂或VhH的板。在平板接种之后24h测量细菌生长的直径。（i)在用含 有蛋白酶的对照缓冲剂（无VhH)温育24h之后对照空肠弯曲杆菌（C. jejuni)，（ii)图像 的图标，（iii)FlagVlM 对照，15 和 30min 消化，（iv)FlagVlMDSB 对照，15 和 30min 消化，（V) FlagVlF23M 对照，15 和 30min 消化，及（vi)FlagVlF23MDSB 对照，15 和 30min 消化。
[0082] 【发明详述】
[0083] 一般而言，本公开涉及与空肠弯曲杆菌（C. jejuni)特异性结合的抗体和其片段。 本文所述的抗体和其片段在食品链中控制或减少空肠弯曲杆菌（C. jejuni)流行中有用。 描述了涉及给动物施用空肠弯曲杆菌（C. jejuni)-特异性单-结构域抗体的方法，其减少 空肠弯曲杆菌（C. jejuni)水平。
[0084] 与空肠弯曲杆菌（C. jejuni)鞭毛特异性结合的分离的或纯化的抗体或其片段， 其包含：
[0085] 互补决定区（CDR)l，其包含序列 GLTFRNFHMA(SEQ ID N0:1)或 VSTFSINALG(SEQ ID NO:4)；
[0086] CDR2,其包含序列 ISWSRDRQ(SEQ ID N0:2)或 IGSDGTV(SEQ ID N0:5);以及
[0087] CDR3，其包含序列 AARTASASGDWYKGSYQY (SEQ ID NO: 3)或 NAAGKRIGSDGSIWFAVASFGS(SEQ ID N0:6)〇
[0088] 纯化的抗体或其片段呈现与空肠弯曲杆菌（C. jejuni)鞭毛特异性结合。可就与 空肠弯曲杆菌（C. jejuni)的鞭毛蛋白的结合，减少空肠弯曲杆菌（C. jejuni)的运动性，或 减少空肠弯曲杆菌（C. jejuni)定居或感染发生率来测定抗-空肠弯曲杆菌（C. jejuni)功 能性。使用本文所述的技术，结合和/或运动性的评估在本领域技术人员的能力范围之内。 在一非限制性例中，纯化的抗体或其片段与鞭毛蛋白特异性结合。在进一步非限制性例中， 纯化的抗体或其片段与鞭毛蛋白的Fla A组分特异性结合。
[0089] 在本文使用的术语"抗体"，也在本领域被称为"免疫球蛋白"（Ig)，指称自配对的 重和轻多肽链构建的蛋白；存在各种Ig同种型，包括IgA，IgD，IgE，IgG和IgM。当抗体正 确地折叠时，各链折叠成许多由更多线性多肽序列接合的不同球形结构域。例如，免疫球蛋 白轻链折叠成可变（')和恒定（CJ结构域，而重链折叠成可变（V H)和3个恒定（CH，CH2，CH3) 结构域。重和轻链可变结构域（VjPVj的相互作用导致抗原结合区（Fv)的形成。各结构 域具有本领域技术人员熟悉的良好建立的结构。
[0090] 轻和重链可变区负责结合靶抗原，和可因此在抗体之间显示显著序列多样性。恒 定区显示更少序列多样性，及负责结合许多天然的蛋白而引发重要生物化学事件。抗体的 可变区含有分子的抗原结合决定子，由此决定抗体对其靶抗原的特异性。大多数序列变异 性发生在6个高可变区，可变重（VH)和轻（')链各3个；高可变区组合而形成抗原-结合 位点，及贡献于抗原决定簇的结合及识别。抗体对其抗原的特异性和亲和性由高可变区的 结构，以及它们的尺寸，呈现给抗原的它们表面的形状和化学决定。对于高可变性区的鉴 定存在各种方案，2种最常见的是Kabat及Chothia和Lesk的那些。Kabat等人（1991a ; 1991b)基于在八结构域的抗原-结合区的序列变异性定义了"互补性-测定区"(CDR)。 Chothia及Lesk(1987)基于V0P八结构域中结构环区的位置定义了"高可变的环"(H或L)。 由于这些个体方案定义相邻或重叠的CDR和高可变的环区，抗体领域的技术人员常常互换 利用术语"CDR"和"高可变的环"，及它们可在本文如此使用。由于此原因，在包含V0P ^ 结构域的抗体的情况中，形成抗原-结合位点的区目前在本文称为CDR L1，CDR L2，CDR L3， CDR H1，⑶R H2,⑶R H3;或在重链或轻链的抗原-结合区的情况中，在本文称为⑶R1，⑶R2， CDR3。在本文根据IMGT编号系统（Lefranc，M. -P.等人，2003)引述CDR/环，所述系统被开 发以辅助可变结构域的比较。在此系统中，保守的氨基酸（诸如Cys23，Trp41，Cysl04，Phe/ TrpllS，及在第89位的疏水残基）总是具有相同的位置。此外，提供框架区（FR1:第1~ 26 位；FR2 :39 ~55 ;FR3 :66 ~104;及 FR4 :118 ~129)及 CDR(CDR1 :27 ~38，CDR2 :56 ~ 65 ;及⑶R3 :105~117)的标准化的划界。
[0091] 在⑶R之外的区被称为框架区（FR)。FR提供可变结构域的结构完整性，及确保免 疫球蛋白折叠的保持。抗体的此特征性结构提供稳定的支架，在其上可由免疫系统探索实 质性抗原-结合多样性，以获得对广泛抗原的特异性（Padlan等人，1994)。
[0092] 在本文指称的"抗体片段"可包括本领域知道的任何适合的抗原-结合抗体片段。 抗体片段可通过操作天然存在的抗体获得，或可通过使用重组方法获得。例如，抗体片段 可包括，但不限于Fv，单链Fv(scFv;将V# VH用肽接头连接而组成的分子），Fab，Fab'， F(ab'）2，单结构域抗体（sdAb)，及这些的多价表现物。
[0093] 在非限制性例中，抗体片段可为源于天然存在的源的单结构域抗体（sdAb)。骆驼 科动物来源（Hamers-Casterman等人，1993)的重链抗体缺乏轻链，由此它们的抗原结合位 点由一个结构域组成，称为VhH。sdAb也已见于藍鱼及被称为VNAR(Greenberg等人，1995; Nuttall等人，2003);其他sdAb可基于人重或轻链序列加工（Jespers等人，2004 ;To等 人，2005)。如本文所用，"sdAb"包括通过噬菌体展示或其他展示技术自任何来源的'， VH，VhH或VNAK|C器直接分离的那些，和由通过人源化，亲和性成熟，稳定，增溶（例如，骆驼 化）或抗体加工的其他方法而该sdAb的进一步修饰产生的那些。也由本发明包括的是保 留sdAb的抗原-结合功能和特异性的同源物，衍生物或片段。
[0094]由于高热稳定性，高去污剂抗性，对蛋白酶的相对高抗性（Dumoulin等人，2002) 和高产生产率（Arbabi-Ghahroudi等人，1997)，SdAb是用于新抗体分子的优良的构件；也 可通过自免疫库分离（Li等人，2009)或由体外亲和性成熟（Davies&Riechmann，1996)将 它们加工为具有非常高亲和性。
[0095]为了应用诸如毒素中和和/或靶向灭活，抗体片段（特别sdAb)可优选是全抗 体（例如，IgG)，由于在原核生物系统中更低产生成本和遗传操作容易。此外，VhH，已显 示当使用重组表达系统作为单体克隆及表达时极其稳定（Arbabi-Ghahroudi等人，1997; Muyldermans2001)。
[0096] 本领域技术人员熟悉单-结构域抗体的结构。sdAb包含保持免疫球蛋白折叠的 单免疫球蛋白结构域；最显著地，仅3个形成抗原-结合位点的CDR。但是，并非所有CDR 可需要结合抗原。例如，及不旨在限制，CDR中的1，2或3个可贡献于抗原被本发明的 sdAb结合及识别。sdAb的⑶R在本文被称为⑶R1，⑶R2和⑶R3,及基于MGT编号系统 (Lefranc，M.-P.等人，2003) 〇
[0097] 如之前陈述，抗体或其片段可为sdAb。sdAb可为骆驼科动物来源的，由此可基 于骆驼科动物框架区；替代性地，CDR可移植进其他抗体结构域的框架区，例如但不限于 VNAR，人V H或人V i框架区。在仍另一替代性的实施方式中，以上描述的CDR可移植进其他类 型的抗体片段（Fv，scFv, Fab)的框架区。本实施方式还包括使用本领域中知道的任何适合 的方法，例如，但不限于CDR移植及镶盖"人源化的"的抗体片段。抗体或抗体片段的人源化 包括序列中的氨基酸用其人对应物取代，如见于人共有序列，而不损失抗原-结合能力或 特异性；当导入人受试者时，此方法减小抗体或其片段的免疫原性。在CDR移植的过程中， 在本文定义的重链CDR中的一个或多于一个可融合或移植进人可变区（V H，或VJ或移植进 其他人抗体片段化框架区（Fv，scFv，Fab)。在该情况中，所述一个或多于一个高可变的环的 构象保守，及sdAb对其靶（即，鞭毛）的亲和性和特异性也保守。CDR移植为本领域所知， 及描述于至少以下文献：US专利No. 6180370, US专利No. 5693761，US专利No. 6054297, US 专利No. 5859205,及欧洲专利No. 626390。镶盖，在本领域也称为"可变区表面再建"，涉及 人源化抗体或片段的溶剂-暴露的位置；由此，埋藏的非-人源化的残基（其可为对于CDR 构象重要）保守，而针对溶剂-暴露的区的免疫学反应的潜力被最小化。镶盖为本领域所 知，及描述于至少以下文献：US专利No. 5869619，US专利No. 5766886，US专利No. 5821123， 及欧洲专利No. 519596。本领域技术人员会充分熟悉制备该人源化的抗体片段的方法。
[0098] 本发明的分离的或纯化的抗体或其片段可包含序列GLTFRNFHMA(SEQ ID N0:1)的 CDR1，序列 ISWSRDRQ(SEQ ID N0:2)的CDR2,及序列 AARTASASGDWYKGSYQY(SEQ ID N0:3)的 CDR3。抗体或其片段可为sdAb。sdAb可为骆驼科动物来源的，由此可基于骆驼科动物框架 区。在更特定例中，分离的或纯化的抗体或其片段可包含以下序列：
[0099] QVX1LX2ESGGGLVQAGGSRRLSCATSGLTFRNFHMAWFRQVAGKEREVVX 3AISffSRDRQYYPDPVKGR FTX4TRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAARTASASGDWYKGSYQYWGQGTQVTVSS(SEQ ID N0:7),
[0100] 其中X1=K或Q ;X2=E或V ;X3=A或C ;X4= I或C;或基本上与之相同的序列。 在进一步非限制性例中，分离的或纯化的抗体或其片段可包含以下序列：
[0101] QVKLEESGGGLVQAGGSRRLSCATSGLTFRNFHMAWFRQVAGKEREVVAAISWSRDRQYYPDPVKGRFT ITRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAARTASASGDWYKGSYQYWGQGTQVTVSS(SEQ ID N0:8)，也在本 文称为FlagVIM ;
[0102] QVQLVESGGGLVQAGGSRRLSCATSGLTFRNFHMAWFRQVAGKEREVVAAISWSRDRQYYPDPVKGRFT ITRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAARTASASGDWYKGSYQYWGQGTQVTVSS(SEQ ID N0:9)，也在本 文称为FlagVlF23M ;
[0103] QVKLEESGGGLVQAGGSRRLSCATSGLTFRNFHMAWFRQVAGKEREVVCAISWSRDRQYYPDPVKGRFT CTRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAARTASASGDWYKGSYQYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:10)，也在本 文称为FlagVIMDSB ;
[0104] QVQLVESGGGLVQAGGSRRLSCATSGLTFRNFHMAWFRQVAGKEREVVCAISWSRDRQYYPDPVKGRFT CTRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAARTASASGDWYKGSYQYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 11)，也在本 文称为FlagVlF23MDSB ;
[0105] 或基本上与之相同的序列。
[0106] 本发明也提供分离的或纯化的抗体或其片段，其包含序列VSTFSINALG(SEQ ID N0:4)的 CDR1，序列 IGSDGTV(SEQ ID N0:5)的 CDR2,及序列 NAAGKRIGSDGSIWFAVASFGS(SEQ ID N0:6)的⑶R3。抗体或其片段可为sdAb。sdAb可为骆驼科动物来源的，由此可基于骆 驼科动物框架区。在更特定例中，分离的或纯化的抗体或其片段可包含以下序列：
[0107]qvx1lx2esggglvqaggslrvsctasvstfsinalgwyrqapgkarelvx 3aigsdgtvyytdsvkgrf tx4srdnakntvslqmsslkpedtavyycnaagkrigsdgsiwfavasfgswgqgtqvtvss(seqID NO:12)
[0108] 其中Xl=K或Q ;X2=E或V ;X3=A或C ;X4= I或C;或基本上与之相同