洗脱缓冲剂实施分级分离。
[0170] 将纯化的蛋白级分合并，及针对PBS透析。将洗脱的级分由SDS-PAGE和蛋白印迹 分析，之后向PBS透析。通过使用理论MW和用ExPASy ProtParam工具（http://expasy. org/tools/protparam. html)计算的消光系数，根据Pace等人，1995测量在280nm处的吸 光度来测定VhH浓度。纯化的单体FlagVIM和FlagV6MVhH的产率为10~80mg/l细菌培 养物（图2)。
[0171] 表1.单体和五聚体VhH克隆的构建中使用的引物，如在实施例4和5中描述
[0172]
【主权项】
1. 与空肠弯曲杆菌（C. jejuni)鞭毛特异性结合的分离的或纯化的抗体或其片段，其 包含 互补决定区（CDR)l，其包含序列GLTFRNFHMA(SEQ ID N0:1)或VSTFSINALG(SEQ ID NO:4)； CDR2,其包含序列ISWSRDRQ(SEQ ID N0:2)或IGSDGTV(SEQ ID N0:5);以及CDR3，其包含序列AARTASASGDffYKGSYQY (SEQ ID NO:3)或 NAAGKRlGSDGSIffFAVASFGS(SEQ ID N0:6)〇
2. 权利要求1的分离的或纯化的抗体或其片段，其包含： 序列GLTFRNFHMA(SEQ ID N0:1)的CDR1， 序列ISWSRDRQ(SEQ ID N0:2)的CDR2,及 序列AARTASASGDWYKGSYQY(SEQ ID N0:3)的CDR3。
3.权利要求2的分离的或纯化的抗体或其片段，其包含以下序列： Qvx1Lx2EsGGGLvQAGGsRRLscATsGLTFRNFHMAffFRQvAGKEREvvx3AlSffSRDRQYYPDPVKGRFTX4T RDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAARTASASGDWYKGSYQYWGQGTQVTVSS(SEQ ID N0:7),其中父1=1(或9;父2=￡或￥ ;父3=4或(：；父4=1或(：；或 基本上与之相同的序列。
4.权利要求2或3的分离的或纯化的抗体或其片段，其包含以下序列： QVKLEESGGGLVQAGGSRRLSCATSGLTFRNFHMAWFRQVAGKEREVVAAISWSRDRQYYPDPVKGRFTITRD NAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAARTASASGDWYKGSYQYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:8)； QVQLVESGGGLVQAGGSRRLSCATSGLTFRNFHMAWFRQVAGKEREVVAAISWSRDRQYYPDPVKGRFTITRD NAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAARTASASGDWYKGSYQYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO :9)； QVKLEESGGGLVQAGGSRRLSCATSGLTFRNFHMAWFRQVAGKEREVVCAISWSRDRQYYPDPVKGRFTCTRD NAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAARTASASGDWYKGSYQYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:10)； QVQLVESGGGLVQAGGSRRLSCATSGLTFRNFHMAWFRQVAGKEREVVCAISWSRDRQYYPDPVKGRFTCTRD NAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAARTASASGDWYKGSYQYWGQGTQVTVSS(SEQ ID N0:11);或 基本上与之相同的序列。
5. 权利要求1的分离的或纯化的抗体或其片段，其包含： 序列VSTFSINALG(SEQ ID N0:4)的CDR1， 序列IGSDGTV(SEQ ID N0:5)的CDR2,及 序列NAAGKRIGSDGSIWFAVASFGS(SEQ ID N0:6)的CDR3。
6. 权利要求5的分离的或纯化的抗体或其片段，其包含以下序列： Qvx1Lx 2Esggglvqaggslrvsctasvstfsinalgwyrqapgkarelvx3Aigsdgtvyytdsvkgrftx 4Sr DNAKNTVSLQMSSLKPEDTAVYYCNAAGKRIGSDGSIWFAVASFGSWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:12),其中父1=1(或9;父2=￡或￥ ;父3=4或(：；父4=1或(：；或 基本上与之相同的序列。
7.权利要求5或6的分离的或纯化的抗体或其片段，其包含以下序列： QVKLEESGGGLVQAGGSLRVSCTASVSTFSINALGWYRQAPGKARELVAAIGSDGTVYYTDSVKGRFTISRDN AKNTVSLQMSSLKPEDTAVYYCNAAGKRIGSDGSIWFAVASFGSWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:13)； QVQLVESGGGLVQAGGSLRVSCTASVSTFSINALGWYRQAPGKARELVAAIGSDGTVYYTDSVKGRFTISRDN AKNTVSLQMSSLKPEDTAVYYCNAAGKRIGSDGSIWFAVASFGSWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:14)； QVKLEESGGGLVQAGGSLRVSCTASVSTFSINALGWYRQAPGKARELVCAIGSDGTVYYTDSVKGRFTCSRDN AKNTVSLQMSSLKPEDTAVYYCNAAGKRIGSDGSIWFAVASFGSWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:15)； QVQLVESGGGLVQAGGSLRVSCTASVSTFSINALGWYRQAPGKARELVCAIGSDGTVYYTDSVKGRFTCSRDN AKNTVSLQMSSLKPEDTAVYYCNAAGKRIGSDGSIWFAVASFGSWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:16);或 基本上与之相同的序列。
8. 权利要求1~7之任一项的分离的或纯化的抗体或其片段，其中所述分离的或纯化 的抗体或其片段与鞭毛蛋白特异性结合。
9. 权利要求1~8之任一项的分离的或纯化的抗体或其片段，其中所述分离的或纯化 的抗体或其片段与鞭毛蛋白的Fla A组分特异性结合。
10. 权利要求1~9之任一项的分离的或纯化的抗体或其片段，其中所述分离的或纯化 的抗体或其片段是单-结构域抗体（sdAb)。
11. 权利要求10的分离的或纯化的抗体或其片段，其中所述SdAb是骆驼科动物来源 的。
12. 权利要求1~11之任一项的分离的或纯化的抗体或其片段，其中所述抗体或其片 段处于多价展示。
13. 权利要求12的分离的或纯化的抗体或其片段，其中所述分离的或纯化的抗体或其 片段作为与vero细胞毒素B亚基的融合蛋白表达。
14. 权利要求13的分离的或纯化的抗体或其片段，其包含选自下列的1个或多于1个 序列： QVKLEESGGGLVQAGGSRRLSCATSGLTFRNFHMAWFRQVAGKEREVVAAISffSRDRQYYPDPVKGRFTIT RDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAARTASASGDWYKGSYQYWGQGTQVTVSSGPGGGSGGGGSTPDCVTGKVEY TKYNDEDTFTVKVGDKELFTNRANLQSLLLSAQITGMTVTIKTNACHNGGGFSEVIFR(SEQ ID NO:19)； QVQLVESGGGLVQAGGSRRLSCATSGLTFRNFHMAWFRQVAGKEREVVAAISffSRDRQYYPDPVKGRFTIT RDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAARTASASGDWYKGSYQYWGQGTQVTVSSGPGGGSGGGGSTPDCVTGKVEY TKYNDEDTFTVKVGDKELFTNRANLQSLLLSAQITGMTVTIKTNACHNGGGFSEVIFR(SEQ ID NO:20)； QVKLEESGGGLVQAGGSRRLSCATSGLTFRNFHMAWFRQVAGKEREVVCAISWSRDRQYYPDPVKGRFTCT RDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAARTASASGDWYKGSYQYWGQGTQVTVSSGPGGGSGGGGSTPDCVTGKVEY TKYNDEDTFTVKVGDKELFTNRANLQSLLLSAQITGMTVTIKTNACHNGGGFSEVIFR(SEQ ID NO:34)； QVQLVESGGGLVQAGGSRRLSCATSGLTFRNFHMAWFRQVAGKEREVVCAISWSRDRQYYPDPVKGRFTCT RDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAARTASASGDWYKGSYQYWGQGTQVTVSSGPGGGSGGGGSTPDCVTGKVEY TKYNDEDTFTVKVGDKELFTNRANLQSLLLSAQITGMTVTIKTNACHNGGGFSEVIFR(SEQ ID NO:35)； QVKLEESGGGLVQAGGSLRVSCTASVSTFSINALGWYRQAPGKARELVAAIGSDGTVYYTDSVKGRFTISR DNAKNTVSLQMSSLKPEDTAVYYCNAAGKRIGSDGSIffFAVASFGSWGQGTQVTVSSGPGGGSGGGGSTPDCVTGK VEYTKYNDEDTFTVKVGDKELFTNRANLQSLLLSAQITGMTVTIKTNACHNGGGFSEVIFR(SEQ ID NO:21)； QVQLVESGGGLVQAGGSLRVSCTASVSTFSINALGWYRQAPGKARELVAAIGSDGTVYYTDSVKGRFTISR DNAKNTVSLQMSSLKPEDTAVYYCNAAGKRIGSDGSIffFAVASFGSWGQGTQVTVSSGPGGGSGGGGSTPDCVTGK VEYTKYNDEDTFTVKVGDKELFTNRANLQSLLLSAQITGMTVTIKTNACHNGGGFSEVIFR(SEQ ID NO:22)； QVKLEESGGGLVQAGGSLRVSCTASVSTFSINALGWYRQAPGKARELVCAIGSDGTVYYTDSVKGRFTCSR DNAKNTVSLQMSSLKPEDTAVYYCNAAGKRIGSDGSIffFAVASFGSWGQGTQVTVSSGPGGGSGGGGSTPDCVTGK VEYTKYNDEDTFTVKVGDKELFTNRANLQSLLLSAQITGMTVTIKTNACHNGGGFSEVIFR(SEQ ID NO:36)； QVQLVESGGGLVQAGGSLRVSCTASVSTFSINALGWYRQAPGKARELVCAIGSDGTVYYTDSVKGRFTCSR DNAKNTVSLQMSSLKPEDTAVYYCNAAGKRIGSDGSIffFAVASFGSWGQGTQVTVSSGPGGGSGGGGSTPDCVTGK VEYTKYNDEDTFTVKVGDKELFTNRANLQSLLLSAQITGMTVTIKTNACHNGGGFSEVIFR(SEQ ID NO:16)； 或 基本上与之相同的序列。
15. 核酸分子，其包含编码权利要求1~14之任一项的分离的或纯化的抗体或其片段 的核酸序列。
16. 载体，其包含权利要求15的核酸分子。
17. 权利要求1~14之任一项的分离的或纯化的抗体或其片段，其中所述抗体或其片 段与可检测的标记物连接。
18. 减少动物或动物环境中空肠弯曲杆菌（C. jejuni)的存在的方法，其包括给动物施 用权利要求1~14之任一项的分离的或纯化的抗体或其片段。
19. 权利要求18的方法，其中所述分离的或纯化的抗体或其片段经口施用。
20. 权利要求19的方法，其中所述分离的或纯化的抗体或其片段包含在酵母表达系统 中。
21. 权利要求18~20之任一项的方法，还包括给动物施用针对空肠弯曲杆菌 (C. jejuni)有效的抗生素、细菌素或其他植物来源的或动物来源的化合物。
22. 权利要求18~21之任一项的方法，还包括随权利要求1~14之任一项的分离的 或纯化的抗体或其片段一起给动物施用竞争微生物，所述竞争微生物任选地在益生系统中 共表达或共含有。
23. 减少空肠弯曲杆菌（C. jejuni)导入动物环境的方法，其包括在将应招者动物导入 动物环境之前，给应招者动物施用权利要求1~14之任一项的分离的或纯化的抗体或其片 段。
24. 空肠弯曲杆菌（C. jejuni)疫苗，其包含权利要求1~14之任一项的分离的或纯化 的抗体或其片段，及赋形剂。
25. 权利要求24的疫苗，其中所述疫苗用于口腔递送。
26. 治疗空肠弯曲杆菌（C. jejuni)感染的受试者的方法，包括给受试者施用权利要求 1~14之任一项的分离的或纯化的抗体或其片段。
27. 权利要求26的方法，还包括给受试者施用针对空肠弯曲杆菌（C. jejuni)有效的抗 生素。
28. 权利要求26或27的方法，其中所述受试者是选自下列的家畜动物：鸡，牛或绵羊。
29. 权利要求26或27的方法，其中所述受试者是人。
30. 用于治疗空肠弯曲杆菌（C. jejuni)感染的制剂，包含权利要求1~14之任一项的 分离的或纯化的抗体或其片段，及赋形剂。
31. 权利要求1~14之任一项的分离的或纯化的抗体或其片段用于制备治疗有需求的 受试者中空肠弯曲杆菌（C. jejuni)感染的药物的用途。
32. 权利要求1~14之任一项的分离的或纯化的抗体或其片段用于治疗有需求的受试 者中空肠弯曲杆菌（c. jejuni)感染的用途。
33. 检测样品中的空肠弯曲杆菌（C. jejuni)的方法，包括使样品接触权利要求1~14 之任一项的分离的或纯化的抗体或其片段，及检测结合的分离的或纯化的抗体或其片段的 存在。
34. 权利要求33的方法，其中所述样品包含体液或粪便物质。
35. 权利要求33的方法，其中所述样品包含食品或来自食品的表面拭子。
36. 用于进行权利要求33的方法的试剂盒，其包含： 权利要求1~14之任一项的分离的或纯化的抗体或其片段、和 用于检测空肠弯曲杆菌（C. jejuni)的使用说明。
37. 用于检测样品中的空肠弯曲杆菌（C. jejuni)的检测试剂，其包含： 权利要求1~14之任一项的分离的或纯化的抗体或其片段、和 适合的载体。
38. 分离的抗-空肠弯曲杆菌（C. jejuni)抗体，其包含权利要求1~14之任一项的分 离的或纯化的抗体或其片段。
【专利摘要】空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)是人中细菌食品源的疾病(从急性腹泻疾病至神经学病症)的主导原因。描述了特异于空肠弯曲杆菌(C.jejuni)的分离的或纯化的抗体或其片段。所述抗体或其片段与鞭毛蛋白结合及减少空肠弯曲杆菌(C.jejuni)的运动性。抗体或其片段源于用空肠弯曲杆菌(C.jejuni)鞭毛蛋白免疫的骆驼科动物动物的重链IgG可变结构域片段(VHH)。描述了抗体或其片段的多价形式，以及噬菌体形式。也描述了减少动物或动物环境中空肠弯曲杆菌(C.jejuni)的存在的方法，用于治疗空肠弯曲杆菌(C.jejuni)感染的方法和制剂，及检测空肠弯曲杆菌(C.jejuni)的方法。
【IPC分类】A61K47-48, C12N15-13, G01N33-569, A61K39-40, C07K16-12, C07K19-00, A61P31-04
【公开号】CN104870472
【申请号】CN201380064695
【发明人】M·阿巴比格赫劳迪, A·瑞尔兹, C·M·西曼斯基, G·哈萨克, J·坦纳, R·麦肯兹
【申请人】加拿大国家研究委员会
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2013年10月24日
【公告号】CA2889398A1, EP2912059A1, WO2014063253A1