基以体积IL计量，包含牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 3g、自来水1000ml，pH范围7.0?7.5，121°C灭菌20min后使用。
[0044](2)将棘孢木霉12接种到PDA培养液，进行液体发酵生产，得到棘孢木霉12发酵液，其发酵生产的条件为:初始pH范围为6.5?7.2，培养温度25?30°C，溶氧通气量范围为30?100%，170rpm,发酵36h，发酵后期菌丝球全部打碎成菌丝片段，发酵液菌株的菌落形成单位彡IX 18Cfu πιΓ1;所用PDA培养液配制方法为(以配制IL培养基为例):用10g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加5g普通蔗糖和2g水稻稻杆粉，定容至1000ml，pH值自然，115°C灭菌30min。
[0045](3)将棘孢木霉12发酵液接种到固体发酵基质中，接种量为体积比5%，23?28°C，发酵8天，低温烘干，粉碎过200目筛，获得棘孢木霉12固体菌粉；所用的固体发酵基质由玉米芯粉和麦麸按照质量比例为1: 1，调节含水量至50?55%制备得到，并于120°C灭菌30min后备用。
[0046]( 二)畜禽养殖污水发酵
[0047](I)将畜禽养殖废水用购自河海大学环境研宄所的微生物菌剂(主要菌种为解淀粉芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和棘孢木霉)进行分解、絮凝沉淀，以除去养殖废水中大量的固形颗粒物、蛔虫卵、部分的微生物，得到畜禽养殖污水；
[0048](2)将枯草芽孢杆菌D9液体发酵液和棘孢木霉T12固体菌粉添加到处理后的畜禽养殖废水(即畜禽养殖污水)中，其中，养殖污水中枯草芽孢杆菌D9液体菌添加量为10L/m3，棘孢木霉T12固体菌粉添加量为10kg/m3。在温室大棚中建发酵槽，槽宽1.2m，槽深2m，将添加菌种的养殖污水转入曝气发酵槽，槽底用直径20mm的PVC管供气，用直径30mm铁管5根铺设于发酵槽底部，通过太阳能吸热管加热水，将热能导于槽底部加热养殖污水，确保发酵污水的温度不超过30°C ;发酵8天，即得到一种利用畜禽养殖废水生产的防除连作障碍的产品，其中，产品中微生物总量> 1XlO8Cfu πιΓ1，枯草芽孢杆菌D9的含量>
0.5 X 17Cfu πιΓ1，棘孢木霉 T12 的含量> 0.1XlO6Cfu ml'
[0049]实施例3本发明的用于防除连作障碍的液体制剂在芦蒿连作障碍地上的应用。
[0050]试验地选址江苏南京栖霞区，土壤连续种植芦蒿5年，第4年冬春芦蒿发病率9 %，第5年冬春芦蒿发病率100%。
[0051]试验设置3个处理，分别为:
[0052](I)对照处理:常规种植；
[0053](2)养殖废水处理:连作土壤施用养殖废水5吨/亩；
[0054](3)本发明产品处理:连作土壤施用本发明的产品(实施例1制备的防除连作障碍的液体制剂)5吨/亩；
[0055]种植芦蒿品种为大叶蒿，采用带有压辊的旋耕机翻动连作土壤，翻动深度15cm，土壤人工打孔完毕后喷施养殖废水或者本发明产品，喷施完毕后，每亩土壤浇水5m3，将土表废水或者本发明产品冲洗入人工打的孔洞，土壤稳定48h，插苗。
[0056]插苗50天后，测定3个处理的累积的发病率，结果如图1所示，对照处理的发病率100%，废水处理和本发明产品处理都能够很好的防控连作病害，其中废水处理的防病率30.6%，本发明产品的防病率93.8%，本发明产品能够很好的防除连作障碍的发生，且每亩芦蒿连作地可消纳养殖废水5?8吨。
[0057]实施例4本发明的用于防除连作障碍的液体制剂在西红柿连作障碍地的应用。
[0058]试验地选址江苏宿迀宿豫区，种植西红柿温室大棚土壤，上一季西红柿青枯病发病率100%，青枯病为细菌性病害，由茄科劳尔氏菌引起。
[0059]试验设置3个处理，分别为:
[0060](I)对照处理:常规种植方法；
[0061](2)养殖废水处理，土壤施用废水15吨/亩；
[0062](3)本发明产品处理，土壤施用本发明产品(实施例2制备的液体制剂)15吨/亩。
[0063]西红柿大棚土壤采用旋耕机翻动，土壤翻动深度25cm，土壤整理成畦，将养殖废水或者本发明产品浇灌于即将移栽西红柿苗的土壤，分多次浇灌，确保将养殖废水或者本发明产品浇灌入土壤，土壤浇灌完毕后，稳定5?10天，移栽西红柿苗。
[0064]移栽前对土壤微生物测定显示，相较于对照处理，废水处理和本发明产品处理距离地表20cm处土壤中芽孢杆菌总量均显著上升(如图2所示)，但是废水处理木霉菌数量和对照没有显著差异。相较于对照处理，本发明处理20cm处土壤木霉菌数量增加了 33倍、芽孢杆菌数量增加了 181倍，因此本发明产品能够显著地增加移栽苗根圈环境的有益微生物数量。
[0065]西红柿栽种60天后，测定的累积的发病率如图3所示，对照处理发病率100%，西红柿主要受到了青枯病的危害，废水处理和本发明产品处理病害的累积发病率分别56.2%和12.7%。本发明产品能够显著地抑制西红柿连作障碍地病害的发生，对病害的防治率达87.3%，同时每亩西红柿种植地可消纳养殖业废水10?20吨。
[0066]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种利用畜禽养殖废水生产的液体制剂，其特征在于，所述液体制剂通过枯草芽孢杆菌D9和棘孢木霉12发酵畜禽养殖污水制备得到，所述利用畜禽养殖废水生产的防除连作障碍的液体制剂中微生物总量> 1XlO8Cfu πιΓ1，其中，有效功能微生物菌落形成单位^ 0.5 X 17Cfu πιΓ1，枯草芽孢杆菌D9的含量> 0.5 X 17Cfu ml—1，棘孢木霉T12的含量>0.1 X 16Cfu Iiir1O
2.根据权利要求1所述的利用畜禽养殖废水生产的液体制剂，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌D9的菌株保藏号为CGMCC N0.9170，于2014年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号；所述的棘孢木霉12的菌株保藏号为CCTCC NO:M2013213，于2013年5月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学。
3.权利要求1所述的利用畜禽养殖废水生产的液体制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)将枯草芽孢杆菌D9接种到枯草芽孢杆菌液体发酵培养基中，制得枯草芽孢杆菌D9发酵液；其中，发酵生产的条件为:初始pH范围为6.5?7.2，培养温度35?37°C，溶氧通气量范围为30?100%，120?180rpm，发酵16?18h，获得枯草芽孢杆菌D9发酵液； (2)将棘孢木霉12接种到PDA培养液，进行液体发酵生产，得到棘孢木霉12发酵液，其发酵生产的条件为:初始PH范围为6.5?7.2，培养温度25?30°C，溶氧通气量范围为30?100%，150?170rpm，发酵30?36h，发酵后期菌丝球全部打碎成菌丝片段，发酵液菌株的菌落形成单位彡I X 18Cfu mr1； (3)将步骤(2)得到的棘孢木霉12发酵液接种到固体发酵基质中，接种量为体积比5%，23?28°C，发酵5?8天，低温烘干，粉碎过200目筛，获得棘孢木霉12固体菌粉； (4)将畜禽养殖废水用微生物菌剂进行分解、絮凝沉淀，除去养殖废水中大量的固形颗粒物、蛔虫卵、部分的微生物，得到畜禽养殖污水； (5)将枯草芽孢杆菌D9液体发酵液和棘孢木霉T12固体菌粉添加到处理后的养殖废水中，枯草芽孢杆菌D9液体菌种按照2?10L/m3畜禽养殖污水、棘孢木霉T12固体菌粉按照2?10kg/m3畜禽养殖污水的比例分别添加到步骤(4)得到的畜禽养殖污水中，将添加菌种的畜禽养殖污水转入曝气发酵槽，槽底供气，通过温室大棚或者太阳能转换器于槽底供热，确保发酵的污水温度不超过30°C ;发酵5?8天，即得一种利用畜禽养殖废水生产液体制剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(I)中，所用的液体发酵培养基以体积IL计量，包含牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 3g、自来水1000ml，pH范围7.0?7.5，于121°C灭菌20min后备用。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤⑵中，所用的PDA培养液配制方法为:以配制IL培养基为例，用10g 土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加5g普通鹿糖和2g水稻稻杆粉，定容至1000ml，pH值自然，于115°C灭菌30min后备用。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所用的固体发酵基质的制备方法为:玉米芯粉:麦麸按照质量比例为1: 1，调节含水量50?55%，于120°C灭菌30min后备用。
7.权利要求1所述的利用畜禽养殖废水生产的液体制剂在防除作物连作障碍中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特在于，在应用中: 对于扦插苗繁殖的作物，采用带有压辊的旋耕机翻动连作土壤，土壤翻动完毕，采用常规的打孔方法打孔后，利用小泵将一种利用畜禽养殖废水生产的防除连作障碍的产品均匀的喷施于田面土壤的表面；采用带有喷头的水管浇灌，将田面的一种利用畜禽养殖废水生产的防除连作障碍的产品冲入上述所打的孔中，田面稳定I?2天，扦插茎杆； 对于采用移栽苗的作物，土壤翻动粉碎，翻动土壤，在田面开一条小沟，向开沟中浇施本产品，土壤稳定I?2天后，移栽作物于田面所开的小沟中。
【专利摘要】本发明公开了一种利用畜禽养殖废水生产的液体制剂及其在防除连作障碍中的应用，其通过枯草芽孢杆菌D9和棘孢木霉12发酵畜禽养殖污水制备得到，所述液体制剂中微生物总量＞10×108cfu ml-1，其中，有效功能微生物菌落形成单位≥0.5×107cfu ml-1，枯草芽孢杆菌D9的含量＞0.5×107cfu ml-1，棘孢木霉T12的含量＞0.1×106cfu ml-1，其能够有效的增加扦插组织或者移栽作物苗根圈周围生防微生物的数量，减少连作土壤中病原菌侵染植物的扦插组织或者移栽苗的几率，有效地防除连作障碍，同时能够消耗大量的养殖业污水。试验表明，芦蒿连作障碍土壤施用该产品后，发病率降低了93.8％，且每亩芦蒿连作地可消纳养殖废水5～8吨；连作西红柿土壤使用该产品后，发病率降低了87.3％，每亩西红柿种植地可消纳养殖业废水10～20吨。CCTCC NO：M201321320130516CGMCC NO.917020140516
【IPC分类】A01N63-04, C12N1-20, A01G1-00, C12R1-885, A01B79-02, C12R1-125, A01P21-00, C12N1-14
【公开号】CN104877927
【申请号】CN201510119919
【发明人】陈立华, 常义军, 王长春, 邵孝候, 常婷婷, 黄忠阳
【申请人】河海大学
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年3月18日