综合微生物的培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物生态学领域，具体涉及一种用于污泥处理的综合微生物的培养方法。
【背景技术】
[0002]综合微生物是由大自然中萃取而出，具有强力分解有机物质的特性，不会受到环境的影响，也不影响环境。氨气、硫化氢、甲基硫醇等造成恶臭的物质皆会被微生物吸收分解。适用温度范围广，且可以抑制病原性大肠菌增加的功效也已经获得公共设施的认可。综合微生物的作用原理是:综合微生物内含有多种微生物群，针对有机废弃物有强烈的分解消化能力，可以将有机物分解成二氧化碳、水和各种无机盐。另外，综合微生物会交互作用将造成环境恶臭的因子分解成其他没有异味的物质，因此不仅可以有效的分解有机废弃物同时也可以消除环境恶臭。
[0003]因此，现在需要开发一种能够快速稳定繁殖综合微生物的培养方法。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是是，提供一种极短的时间内，可培养出大量的污水和污泥等处理过程中所需要的微生物，且所培养的微生物菌类稳定并使处理效果达到最好综合微生物的培养方法。
[0005]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:该综合微生物的培养方法，包括以下步骤:
(O前期准备:
(A)灭菌处理:分别对实验操作空间、操作者衣着和手进行清洁和消毒；对培养桶槽和培养皿进行灭菌处理；
(B)制备B1lite水:取大于预定培菌体积的自来水置入干净桶槽内；在所述桶槽内加入B1lite丝光细粉；于所述桶槽内导入曝气，曝气方式为连续曝气，曝气时间为不小于24h;曝气完成后静置3~5天，并测定水中的金属离子的含量，直至水中的金属离子含量为零后待用；
(C)检查设备和材料:观察培菌桶槽的外观是否完整无破损，排水孔洞的盖子是否旋紧；检查曝气设备是否安装完成，曝气设备以及其阀门是否正常工作；检查培菌所需的材料的种类和数量是否正确；
(2)按比例配制培养材料，所述培养材料包括MOLT原生菌液、SOFT生菌粉体、B1lite丝光细粉、光合成菌液GPB、B1lite水和有机营养物；
(3)导入曝气，进行繁殖培养:将步骤(2)中的培养材料放入培养桶槽，并在培养桶内加入营养物质，所述营养物质包括碳源、氮源、无机盐类及水源；培养基的PH值为6~10，培菌室的温度为0~60°C ;曝气方式为连续曝气和微曝气，首先进行连续曝气，连续曝气的时间至少为7天；连续曝气完成后，再进行微曝气，微曝气时间至少24h ;后续培养的过程中，可以根据菌种繁殖的状况进行连续曝气与微曝气轮换曝气；从而得到繁殖的MOLT菌液；
(4)取液观察:
(a)取液:取出所述步骤(3)中得到的繁殖的MOLT菌液，待用；
(b)稀释菌液:将步骤(a)中所取出的待用的MOLT菌液，分别取出等量的3份，分别加入生理盐水稀释为1000倍、10000倍和100000倍，得到三种不同比例的稀释菌液；
(c)平板培养:将步骤(b)中的三种不同比例的稀释菌液用针筒分别取出等量的稀释菌液放入3个具有培养基的培养皿中，将接种环在酒精灯火焰上灼烧直至烧红，在酒精灯火焰旁冷却接种环，将接种环伸入平板内，按“之”字形划线，使菌液均匀分布，盖上培养皿盖，不要划破培养基；将平板倒置放在培养箱中，培养温度为30~40°C，培养时间至少为24h ;观察并拍摄照片记录不同培养时间下的各种菌的菌种和菌相；
(5)分离并检测:同时将步骤(3)中得到的繁殖的MOLT菌液采用DGGE电泳设备进行分离并检测，并分析图谱；
(6)取液储存:当观察发现步骤(3)中的菌液中菌数达到标准，取出培养桶槽内菌液总重量的6~8%的菌液进行放置保存，然后在按比例添加培养材料至培养桶槽内，使菌液总重量维持不变；同时将曝气方式改为连续曝气，连续曝气时间至少为24h，连续曝气完成后，再进行微曝气，并重复步骤(4)和步骤(5)，直至观察发现菌液中菌数达到标准，则重复步骤(6)的上述操作。
[0006]MOLT (综合微生物菌):从大自然中无污染的深层土壤中提取出的，经过特殊的筛选，驯化、培育方式得到现在的综合微生物菌。SOFT生菌粉体(辅助材料，有机载体):内含腐殖质等物质。B1lite粉(辅助材料，无机载体):有很强的吸附作用，由沸石和其他材料制成。采用上述技术方案，B1lite粉具有强的吸附作用，可以吸附对微生物生理活性具有抑制作用的某些无机物和吸附臭味；在培养过程中主要观测重金属离子(如锌、铜、镍、铅、铬等)，防止重金属离子进入菌液中；在培菌时需要加入水，采用B1lite粉调制自来水制成B1lite水，在使用前要用仪器检测水体中是否含有重金属离子；由于B1lite粉具有强的吸附作用，能将金属离子吸附，因此若检测出水体中含有金属离子，则再添加B1lite粉进行吸附，从而获得对综合微生物最有利的培养环境；通过曝气设备，曝气设备中含有粗泡散气盘组，可以为微生物由下而上提供空气供养，可以使得微生物更好更快地繁殖并处理污泥；轮换式微曝气是为了让厌氧微生物进行繁殖，保持总菌相中好氧菌和厌氧菌的比例；培养室的温度为恒温的，可以使微生物更好的快速稳定的繁殖；在使用菌液或进行下一步培养前需进行取液观察，观察菌桶槽中的菌数，同时进行基因突变检测；最后通过稀释观察微生物的繁殖状况，以及同时采用DGGE电泳设备测试繁殖后的MOLT菌液有无基因突变情况，如果检测发现没有基因突变则继续进行培养；其次在培养过程中，有机营养物的提供也非常重要；在微生物菌的生命活动过程中，需要不断吸收必须的营养物质，包括:碳源、氮源、无机盐类及其他生长素等；而本发明中添加的有机物以畜牧业的固液废弃物为主，猪粪尿类中的碳源较多，沼液类中的氮源较多，综合后提供给微生物营养，既可培育微生物又可处理废液。因此在培育过程中，每周定期做培养皿观察菌数变化，如果微生物连续两周持续下降，则表示营养源不足，已经开始衰亡。根据我们的经验，加足了营养成分后，大概可以持续维持72?75天左右(微曝气的情况下);一般来说，菌数的最高峰在45?55天的时间段；而营养过多，有可能会分解不完全；一般在正常的培养过程中，不会有臭味产生；但若是添加的营养过多，曝气不充分时，会产生臭味。当培菌期间突然出现臭味时，由于Do长期过低，此时要曝气全开，连续曝气2小时后改为微曝气；微生物菌适应的PH范围是6~10，要让好氧菌和厌氧菌在比例左右共同繁殖；改为当测定的PH大于10时，此时主要是厌氧菌对营养物质的分解吸收，要加大曝气使好氧菌繁殖；当PH小于6时，此时主要是好氧菌的活动，要减小曝气。此外，观察菌液并计数生长菌落，必要时可用功放大镜辅助观察；若一般生菌数多200CFU，放线菌多200CFU，出血性d大肠杆菌无生长则表示可以取液保存；若未达到标准则继续培养；若有疑似出血性大肠杆菌的菌落产生，则须作进一步的检查以及紧急处理；取液储存主要是为了增加菌液，从而可以使繁殖后的菌液的重量在短时间内增加，可以缩短微生物培养时间，节约成本，提高培养效率。
[0007]本发明进一步的改进在于，所述步骤(I)中的(A)步骤的灭菌方法为化学药剂消毒法，即采用75%的无水乙醇消毒后再采用紫外线消毒法，在紫外线照射下消毒至少lh，以达到灭菌的目的。微生物培养成功的关键在于无菌操作，如果培养器具和培养基不能彻底灭菌、培养的过程中有杂菌污染是很容易失败的，因此采用紫外线消毒可以进一步更好灭菌；同时为了避免周围微生物的污染，操作培养的过程中需要在酒精灯火焰旁操作。
[0008]本发明进一步的改进在于，所述步骤(I)中的(B)步骤中加入B1lite丝光细粉的量为自来水重量的0.5%~0.8%ο根据B1lite水的作用通过大量的实验证实，B1lite丝光细粉加入量为0.5%~0.8%，可以很好地将自来水中的金属离子吸附。
[0009]本发明进一步的改进在于，当培养方式为原代培养时，所述步骤(2)中的培养材料的体积比例为:M0LT原生菌液占总体积的63%~68%，SOFT生菌粉体占总体积的1%~3%，B1lite丝光细粉占总体积的0.05%~0.15%，光合成菌液GPB占总体积的0.5%~1.0%，B1lite水占总体积的30%~35%，有机营养物占总体积的0.5%~1%。原代培养也称初代培养，严格地说即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养；一般持续1~4周；此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构