五种二苯乙烯三聚体的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及化合物领域，尤其涉及五种二苯乙烯三聚体的制备方法及其作为制备 α-葡萄糖苷酶抑制剂药物的应用。
【背景技术】
[0002] α -葡萄糖苷酶抑制剂（AGHI)是二十世纪八十年代出现的一类新的抗糖尿病药 物，它能通过抑制小肠上皮绒毛膜上的α-葡萄糖苷酶的作用来延缓碳水化合物的消化， 进而有效推迟糖尿病人餐后血糖升高的时间及进程，降低糖尿病风险。目前，以阿卡波糖， 伏格列波糖为代表的AGHI已成为治疗II型糖尿病的一线药物，也可作为治疗I型糖尿病 的辅助药物。然而，由于这些人工合成的AGHI具有的一些较为明显的副作用（N. Engl. J. Med.，2007, 356, 1499-1501.)，如肝脏疾病，肠胃气胀，腹部痉挛等，因此，人们在过去的 二十年中一直试图从动植物和食品中去寻找毒副作用较小的天然AGHI。
[0003] 可以预见的是，随着老龄化社会的到来，我国的糖尿病发病率越来越高，并且我国 以及东南亚地区饮食习惯以碳水化合物为主，因此，开发高效、低毒的AGHI具有巨大的经 济效益和社会效益。我国中药资源丰富，许多药材均已被长期的临床实践证明具有较好的 降糖作用，将这些具有确切降糖疗效的中药材进行深入系统的活性成分筛选研宄，开发出 新的高效、低毒的AGHI的可能性将会比传统的"盲筛"要大得多。
[0004] 基于上述分析，我们对临床常用的31种具有降糖作用的中药材进行了体外α-葡 萄糖苷酶(AGH)抑制活性初筛，结果表明，槐米、甘草、僵蚕、香附子等药材醇提物对AGH具 有很高的抑制活性，尤以香附子活性为最强，因此我们对香附子的AGHI进行了深入的研 宄。
[0005] 香附子为莎草科植物莎草（分/76?/7/5· roiWflofe L.)的干燥根莖，辛、微苦、微甘， 平；归肝、脾、三焦经；具有行气解郁、调经止痛的功效，为中医临床的常用中药。药理研宄 表明，香附子具有抗炎、降血糖、抗血小板、保护神经系统、抗过敏反应等作用。Raut NA等发 现（Fitoterapia，2006, 77, 585-588.)香附子水醇提取物能有效降低四氧嘧啶诱导的糖尿 病大鼠的血糖；Ardestani A 等发现（Int. J Biol. Macromol.，2007, 41，572-578.)不同浓 度的香附子水醇提取物（25-250 μ g/mL)能显著抑制晚期糖基化终产物（AGES)的形成。由 此可见，香附子的确具备治疗糖尿病的潜力。Tran HHT等（Pharm. Biol·，2014, 52, 74-77.) 采用常规系统分离方法，从香附子中分离出了三种二苯乙烯二聚体化合物（cassigarol E, scirpusin A、scirpusin B)，具有一定的 AGH 抑制活性。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种以体外α -葡萄糖苷酶抑制活性为导向、化学分离与 活性评价同步进行的二苯乙烯三聚体化合物的制备方法及其作为制备α-葡萄糖苷酶抑 制剂药物的应用。
[0007] 为实现本发明的上述目的，本发明提供五种二苯乙烯三聚体化合物的制备方法， 包括如下步骤。
[0008] 步骤1、药材超声提取：将香附子粉末用80%甲醇冷浸后超声提取，所得提取物用 水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别得到石油醚提取部位、乙酸乙酯提取部 位及正丁醇提取部位；将各提取部位分别制成不同浓度的DMSO溶液，进行体外AGH抑制活 性检测，确定乙酸乙酯活性部位活性最强。
[0009] 步骤2、硅胶柱层析分离：所述乙酸乙酯提取部位采用硅胶常压层析分离，分别用 不同比例的石油醚、二氯甲烷、甲醇混合溶剂梯度洗脱，所述二氯甲烷与甲醇的体积比分别 为9:1、7:3、5:5 ;然后分别收集各洗脱液，减压浓缩回收溶剂，得各提取部位；将各提取部 位分别制成不同浓度的DMSO溶液，进行体外AGH抑制活性检测，确定二氯甲烷与甲醇的体 积比为7:3的提取部位活性最强。
[0010] 步骤3、大孔树脂柱层析分离：将步骤2中所得活性最强部位用HPDlOl型大孔吸 附树脂分离，分别用40%甲醇水溶液、60%甲醇水溶液、80%甲醇水溶液、100%甲醇梯度洗脱； 分别收集各洗脱液，减压浓缩回收溶剂，得各提取部位；将各提取部位分别制成不同浓度的 DMSO溶液，进行体外AGH抑制活性检测，确定60%甲醇水溶液的提取部位活性最强。
[0011] 步骤4、凝胶柱层析分离：将步骤3中所得活性最强部位用S印hadex LH-20凝胶 纯化分离，甲醇洗脱，流速控制为30mL/h，每0. 25个柱体积（即0. 25BV)收集一次，共收集洗 脱液4BV ;将各洗脱液进行体外AGH抑制活性检测，确定2. 25-3. 25 BV洗脱部位活性最强。
[0012] 步骤5、反相制备HPLC分离：将步骤4中所得活性最强洗脱部位采用反相制备型 高效液相色谱进行纯化，40%甲醇-60%水溶液等度洗脱，分别收集保留时间为8. I min、 10. 6 min、11.9 min、17. 7 min和19. 6 min的流份，冷冻干燥后分别得到纯度大于95%的五 种二苯乙烯三聚体化合物。
[0013] 所述保留时间为8. Imin的流份冷冻干燥后得到（±)-(E)_cyperusphenol A，即 化合物1 ;所述保留时间为10. 6 min的流份冷冻干燥后得到cyperusphenol B，即化合物2 ; 所述保留时间为11. 9 min的流份冷冻干燥后得到cyperusphenol D，即化合物3 ;所述保留 时间为17. 7 min的流份冷冻干燥后得到（E)-mesocyperusphenol A，即化合物4;所述保留 时间为19. 6min的流份冷冻干燥后得到cyperusphenol C，即化合物5。
[0014] 所述五种二苯乙烯三聚体化合物（即化合物1-5)的结构式分别依次如下所示。
[0015] 本发明还提供五种二苯乙烯三聚体化合物作为制备α -葡萄糖苷酶抑制剂药物 的应用，可用于防治II型糖尿病。
[0016] 与现有技术相比本发明的有益效果。
[0017] 本发明提供的五种二苯乙烯三聚体的制备方法，以对硝基酚- a -D-吡喃葡萄糖 苷为底物的酶-抑制药的体外筛选模型为活性指导，经硅胶、大孔树脂、凝胶的初步柱分离 后，以制备型高效液相色谱为主要分离手段，通过一步高效液相制备，可同时直接获得纯度 大于95%的五种二苯乙烯三聚体。并且，以体外AGH抑制活性为导向，首次将体外AGH抑 制活性检测与香附子有效成分分离相结合，避免了香附子的常规系统分离法中存在的工作 量大、周期长、过程繁琐等不足，具有目标明确、经济环保等优点。该制备方法能有效减少 分离工作的盲目性，省去了一些不必要的分离制备过程，实现了化学分离与活性评价的同 步进行。除此之外，以制备型高效液相色谱同时制备五种二苯乙烯三聚体具有分离制备工 艺简单、分离过程快速省时、制备产品纯度高、原料充分利用的特点。另外，本发明首次公 开了五种二苯乙烯三聚体化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，以及其作为制备α-葡 萄糖苷酶抑制剂药物的应用。该二苯乙烯三聚体化合物AGH抑制活性比二苯乙烯二聚体 (Scirpusins A、Scirpusins Β)强约5-10倍，比阳性对照药(阿卡波糖）强1000倍，是一类 AGH强效抑制剂。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合具体实施例进一步详细说明本发明。
[0019] 本实施例提供的五种二苯乙烯三聚体化合物（即化合物1-5)的制备方法，包括如 下步骤。
[0020] 步骤1、药材超声提取：将香附子药材(购于大连市阳光大药房）粉碎，取粉末 240g，用2500mL的80%甲醇冷浸24h后超声提取3次，每次lh，合并三次提取液，减压回收 得到提取物总浸膏25. 5g。然后用300mL的水分散，再依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正 丁醇各萃取3次，分别合并各萃取液，减压浓缩回收溶剂，分别得到石油醚提取部位、乙酸 乙酯提取部位、正丁醇提取部位。将石油醚提取部位、乙酸乙酯提取部位、正丁醇提取部位 分别制成3. Omg/mL与0. 3mg/mL的DMSO溶液，各取20 μ L进行体外AGH抑制活性检测，得 到活性最强的乙酸乙酯活性部位5. 4g。
[0021] 步骤2、硅胶柱层析分离：取乙酸乙酯活性部位浸膏5g，少量乙酸乙酯溶解，湿法 上样，硅胶常压层析（40X2. 5cm)分离，柱体积120mL;分别用3倍柱体积（BV)的石油醚、 二氯甲烷、甲醇混合溶剂梯度洗脱，所述二氯甲烷与甲醇的体积比分别为9:1、7:3、5:5,然 后分别收集各洗脱液，减压浓缩回收溶剂，得各提取部位；将各部位分别制成300 μ g/mL与 30 μ g/mL的DMSO溶液，各取20 μ L进行体外AGH抑制活性检测，得到活性最强的二氯甲烷 与甲醇的体积比为7:3的部位0. 7g。
[0022] 步骤3、大孔树脂柱层析分离：将步骤2中所得活性最强部位用4mL 40%甲醇溶 解，15000rpm离心，取上清液0. 44g，HPDlOl型大孔吸附树脂柱（40 X 2. 5cm)分离，柱体积 30mL ;分别用5BV的40%甲醇水溶液、60%甲醇水溶液、80%甲醇水溶液、100%甲醇梯度洗脱， 分别收集各洗脱液，减压浓缩回收溶剂，得各提取部位；将各提取部位分别制成300 μ g/mL 与30 μ g/mL的DMSO溶液，各取20 μ L进行体外AGH抑制活性跟踪检测，得到活性最强的 60%甲醇水溶液的部位0. 21g。
[0023] 步骤4、凝胶柱层析分离：将步骤3中所得活性最强部位用3mL甲醇溶解，Sephadex LH-20凝胶柱（80 X Icm)纯化分离，柱体积60mL，洗脱溶剂为纯甲醇，流速控制为30mL/h，每 0. 25个柱体积（即0. 25BV)收集一次，共收集洗脱液4BV ;将各管洗脱液各取20 μ L，直接进 行体外AGH抑制活性检测，得到活性最强的2. 25-3. 25 BV洗脱部位0. 12g。
[0024] 步骤5、反相制备HPLC分离：将步骤4中所得活性最强洗脱部位采用反相制备 型高效液相色谱进行纯化，色谱柱：Chromatorex C