%次氯酸钠室温5min消毒后，均匀涂布在MS平板上（含潮霉素 25mg/L)。4°C处理3天后转移至22°C培养箱生长。萌发约7-10天，转基因植株的叶深绿， 根较长；非转化的植株叶浅绿，根短，不能长期存活。将转化体移入营养土中生长直到收Tl 代种子。Tl代种子按上述方法筛选，收T2代种子（每个株系收多个单株）。每个T2代单 株种子分别筛选，种植，收集每个单株的T3代种子，筛选每个单株的T3代种子，后代不分离 的（均对潮霉素有抗性）进行下一步鉴定。
[0020] ZmGolS2基因核苷酸序列：
[0021] ATGGCTCCCGAGCTGATGACAGCCAAGATGACCGCCAAAGCCGCGGCGGCGGCGGCGGCGGTGAAGCCT GCCACGAGGGCGTACGTGACGTTCCTTGCGGGCGACGGCGACTACTGGAAGGGCGTGGTGGGGCTGGCCAAAGGCCT GCGCAAGGTCCGCTCGGCCTACCCCCTGGTGGTGGCGGTGCTGCCCGACGTGCCCGAGTCCCACCGCCGCATCCTCG TCTCGCAGGGCTGCGTCGTCCGCGAGATCGAGCCCGTGTACCCGCCTGAGAACCAGACGCAGTTCGCCATGGCGTAC TACGTCATCAACTACTCCAAGCTCCGCATCTGGGAGTTCGTGGAGTACGAGAGGATGGTGTACCTGGACGCGGACAT CCAGGTGTTCGAGAACATCGACGGCCTGTTCGAGCTCGAGAAGGGGTACTTCTACGCGGTGATGGACTGCTTCTGCG AGAAGACGTGGAGCCACACCCCGCAGTACAGGATCGGCTACTGCCAGCAGTGCCCGGACAAGGTGGCGTGGCCAGCG GCGACCGCCGAGCTGGGCCCTCCGCCGTCGCTCTACTTCAACGCCGGCATGTTCGTGCACGAGCCCAGCGTGGCCAC CGCCAAGGCGCTCCTCGACACCCTCCGCGTGACTCCGCCCACCCCCTTCGCAGAGCAGGACTTCCTGAACATGTTCT TCAGGGATCAGTACAGGCCGATCCCCAACGTGTACAACCTCGTGCTGGCCATGCTCTGGAGGCACCCCGAGAACGTG CAGCTGGAGAAGGTGAAGGTCGTGCACTACTGCGCGGCGGGGTCCAAGCCGTGGAGGTTCACGGGCAAGGAGGCGAA CATGGACAGGGAGGACATCAACGCCCTGGTGAACAAGTGGTGGGACATCTACAACGACGAGACGCTGGACTTGAAGG GCCTGCCCTCGCTCTCGCCCGACGACGACGACGAGGTGGAGGCGGTGGCCAAGAAGCCGCTTCGCGCGGCCCTGGCG GAGGCCGGCACGGTCAAGTACGTCACCGCGCCCTCGGCCGCGTGAo
[0022] ZmGo 1S2基因蛋白序列：
[0023] MAPELMTAKMTAKAAAAAAAVKPATRAYVTFLA ⑶⑶ YWKGWGLAKGLRKVRSAYPLWAVLPDVPES HRRILVSQGCVVREIEPVYPPENQTQFAMAYYVINYSKLRIWEFVEYERMVYLDADIQVFENIDGLFELEKGYFYAV MDCFCEKTWSHTPQYRIGYCQQCPDKVAWPAATAELGPPPSLYFNAGMFVHEPSVATAKALLDTLRVTPPTPFAEQD FLNMFFRDQYRPIPNVYNLVLAMLWRHPENVQLEKVKVVHYCAAGSKPWRFTGKEANMDREDINALVNKffffDIYNDE TLDLKGLPSLSPDDDDEVEAVAKKPLRAALAEAGTVKYVTAPSAA〇
[0024] 2、发明人发现在植物中超表达玉米ZmGolS2基因提高了植物叶片中肌醇半乳糖 苷和棉子糖的含量。
[0025] 通过RT-PCR对转化的植株进行基因表达水平鉴定。
[0026] 扩增程序为：94°0预变性51^11;94°0变性3〇8,60°0退火3〇8,72°0延伸3〇8,24个 循环；72°C终延伸8min。
[0027] 对超表达玉米ZmGolS2拟南芥植株糖含量测定方法如下：将鉴定出的超表达玉米 ZmGo 1S2的拟南芥3个株系T3代纯合种子与WT和超表达GFP种子先在MS培养基上生长2 周，后移入营养土中生长4周，每个株系采0. 5克叶片组织，3个生物学重复。液氮研磨至粉 末后加入5ml 80%乙醇（含200 μ g/ml乳糖），继续研磨至匀浆。将匀浆倒入IOml离心管 中，再往研钵中加入2ml 80%乙醇（含200 μg/ml乳糖），清洗研钵，合并在离心管中。将 样品置于80°C水浴锅中加热30min。室温，12000*g离心20min。将上清转移至另一干净的 离心管中。95°C加热，将乙醇蒸发。将样品在_80°C冰箱中冻存24小时。真空抽干。HPLC 级双蒸水将样品重悬。12000*g离心20min。上清冻存于-20°C冰箱中。测定前用0. 22ym 过滤。HPLC检测器为waters2424ELSD，色谱柱为Waters Xbrige氨基柱。上样量为5μ1。 在拟南芥中超表达玉米ZmGolS2基因提高了叶片中肌醇半乳糖苷和棉子糖的含量，如图2d 所示。
[0028] 3、发明人发现在植物中超表达玉米ZmGolS2基因提高了植物抗旱、抗高温、抗盐 能力。
[0029] 转基因拟南芥苗期抗旱性检测：称取相同重量的营养土于四孔小盆中，然后通过 底部吸水使土表完全湿润，称量吸水后盆重。保持盆重量恒定。然后将MS培养基上生长的 幼苗移入盆中，每盆8株，每株系3个生物学重复。正常生长14天后，不浇水处理14天，观 察表型并拍照，然后复水恢复7天，后统计存活率。
[0030] 转基因拟南芥苗期抗盐性检测：称取相同重量的营养土于四孔小盆中，然后通过 底部吸水使土表完全湿润，称量吸水后盆重。保持盆重量恒定。然后将MS培养基上生长的 幼苗移入盆中，每盆8株，每株系3个生物学重复。正常生长14天后，每2天浇一次含有 200mM NaCl的自来水，每次充分吸水，共浇7次。14天后观察表型并测定叶片电导率，电导 测定方法参考【背景技术】中的参考文献4。
[0031] 转基因拟南芥苗期抗热性检测：将MS培养基上生长（22°C，16/8光周期，相对湿度 60% ) 5天的拟南芥幼苗移入事先浸有4ml培养液的双层Waterman滤纸上，22°C正常生长2 天，然后45°C处理1小时。热激处理后放置于22°C条件下（16/8光周期，相对湿度60% ) 恢复培养7天后测定存活率。
[0032] 在拟南芥中超表达玉米ZmGolS2基因提高了植物抗旱、抗高温、抗盐能力，参见图 2-5 〇
【主权项】
1. 在植物中超表达玉米ZmGolS2基因或ZmGolS2基因的功能序列提高植物抗旱、抗高 温、抗盐能力的应用。2. 在植物中超表达玉米ZmGolS2基因或ZmGolS2基因的功能序列提高植物中肌醇半乳 糖苷和棉子糖含量的应用。
【专利摘要】本发明涉及玉米ZmGolS2基因提高植物抗旱、抗高温、抗盐能力的应用。发明人通过超表达玉米GRMZM5G872256基因(命名为ZmGOLS2)提高植物叶片中肌醇半乳糖苷和棉子糖含量，提高植物抗旱、抗热、抗盐的方法。通过同源克隆，用PCR方法克隆了玉米ZmGolS2基因。构建了用35S启动子调控该基因的表达载体。将该载体用农杆菌介导方法转入植物拟南芥后，转基因植株叶片肌醇半乳糖苷和棉子糖含量显著提高，转基因植株的抗旱、抗热和抗盐能力显著提高。该基因超表达植株在正常条件下生长正常，表现优于已知抗逆基因ZmDREB2A超表达植株。在干旱、高温、高盐胁迫条件下该基因生长优于对照，并和ZmDREB2A超表达植株生长类似。
【IPC分类】C12N15/29, C12N15/82, A01H5/00
【公开号】CN104946662
【申请号】CN201510190988
【发明人】赵天永, 谷雷, 张玉民, 张明帅
【申请人】西北农林科技大学
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年4月21日