G，其中一个T突变为G，并且对应的密码子由一个终止密码子（TAA)突变为具有编码氨基酸 能力的氨基酸（GAA)。
【具体实施方式】
[0035] 为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但 本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
[0036] 实施例1琯溪蜜柚红肉突变体突变位点的挖掘
[0037] 1、制备琯溪蜜柚红肉突变体的基因组DNA
[0038] 在本实施例中，采用改良的CTAB法提取琯溪蜜柚野生型及其红肉突变体的四个 组织（外果皮、中果皮、囊衣和汁胞）的基因组DNA。
[0039] 2、基因组测序
[0040] 2. I DNA测序文库的构建
[0041] 基因组DNA的片段化（用超声波打断仪将基因组DNA打断为200-1000bp的范围）； 末端补平（产生平端的5'磷酸化片段）；磁珠纯化；加 A(添加 dAMP到双链DNA文库片段 的3'端）；加接头（连接带有3'-dTMP端的双链DNA接头到文库片段）；磁珠纯化；切胶回 收500bp左右大小的DNA片段；文库扩增（PCR扩增两端都带有特异接头序列的文库片段）； 磁珠纯化。
[0042] 2.1 DNA文库的测序
[0043] 对建好的DNA文库用Qubit 2. 0测定质量浓度，用Agilent 2100生物分析仪检测 插入片段大小，用QPCR测定摩尔浓度，当质量浓度多2nM、插入片段集中且符合目的大小即 可判定文库合格。根据所需30X的数据量对各个文库取样，用hiseq2000-PE125的测序策 略上机测序。
[0044] 3、SNP 分析
[0045] 对测序得到的野生型柚和突变型柚的各个组织数据进行质量检测，并用 Trimmomatic-O. 30去除其中低质量的部分（碱基质量高于28,长度大于20)，得到各组材料 高质量的测序reads ;以甜橙基因组为参考基因组，使用软件BWA将各组reads比对到基因 组上；使用 samtools/GATK 进行 SNP calling 和 genotyping(最小深度为 5, mapping 质量 值高于40)的流程，得到各组材料全基因组范围内的SNP多态性位点。
[0046] 4、突变位点挖掘
[0047] 根据检测到的所有的SNP的信息，使用熵权法对SNP的QUAL、DP和MQ属性赋权 值，从而计算出各组材料各个SNP位点的Q值，用以综合衡量该处SNP的可靠性；将野生型 柚和突变型柚中的SNP的Q值进行对应比较，采用wilcoxon秩检验，并用BH法对p值进行 校正，找到野生型柚和突变型柚中Q值显著不同（p〈〇. 05)，即可靠的SNP位点；对上述找到 的SNP位点，用beagle软件对野生型柚和突变型柚设计case-control型的关联分析，得到 突变相关的5个候选位点。实验见表1。
[0048] 表1.利用突变体红肉琯溪蜜柚和野生型白肉琯溪蜜柚基因组比较筛选得到候选 突变位点
[0049]
[0050] 5、相关突变位点的验证
[0051] 根据5个候选SNP位点所在的序列设计特异性引物（引物信息见表2)，以琯溪蜜 柚野生型及其红肉突变体的四个组织（外果皮、中果皮、囊衣和汁胞）的基因组DNA为模 板，用PCR进行扩增（反应体系为：4ul PCRbuffer，0.4ul dNTPs，0.2ul pfu聚合酶（均购 自于湖北晶茂公司），IOOng DNA，正、反向引物各0. 6 μ 1，CldH2O补充至终体积20 μ 1。热循环 参数为：95°C 5min ;95°C 30sec，55°C 45sec，72°C 45sec，35 个循环；72°C 10min，l 个循环； 4°C保存，反应是在SlOOOThermal Cycler PCR仪上完成。扩增产物在水平电泳槽上1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测，使用IXTAE缓冲液（0.04M Tris-acetate，0.001M EDTA，ρΗ8·0)，电 压8V/cm，电泳30min。电泳完毕，凝胶成像系统（UVP)拍照保存），对所获得的扩增产物直 接测序，比较各个体的PCR产物序列，验证该目的序列，最终确定统计水平最显著的候选位 点即5号染色体上的SNP位点为突变位点。
[0052] 表2:5个SNP候选位点所在染色体位置及根据其所在序列设计的特异性引物信息 及PCR产物长度
[0053]
[0054] 其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描 述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经 创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
【主权项】
1. 一种基于基因组测序的体细胞突变位点挖掘方法，其特征在于：包括以下步骤： 1) 首先对野生型柚和突变型柚的果皮、果肉各个组织进行深度30X的DNA重测序，并对 得到的数据进行质量检测，去除其中低质量的部分，得到各组材料高质量的测序reads ; 2) 然后以已发布的甜橙基因组为参考基因组，使用软件BWA将各组reads比对到基因 组上；再使用samtools/GATK进行SNP calling和genotyping，得到各组材料的多态性位 占. 3) 根据检测到的所有的SNP的信息，使用熵权法对SNP的QUAUDP和MQ属性赋权值， 从而计算出各组材料各个SNP位点的Q值；并综合衡量该处SNP的可靠性；将野生型柚和突 变型柚中的SNP的Q值进行对应比较， 4) 采用wilcoxon秩检验，并用BH法对p值进行校正，找到野生型柚和突变型柚中 Q值显著不同即可靠的SNP位点；对上述找到的SNP位点，对野生型柚和突变型柚设计 case-control型的关联分析，得到突变相关的候选位点；对找到的候选SNP位点进行注释， 并推测性状相关变异发生的染色体区域； 5) 最后利用Sanger测序方法对候选位点进行实验验证。2. 根据权利要求1所述基于基因组测序的体细胞突变位点挖掘方法，其特征在于：所 述方法还用于果树芽变位点的挖掘和鉴定。3. 根据权利要求1所述基于基因组测序的体细胞突变位点挖掘方法，其特征在于：所 述方法还用于木本植物体细胞突变位点的挖掘和鉴定。4. 根据权利要求1所述基于基因组测序的体细胞突变位点挖掘方法，其特征在于：包 括以下步骤： 1) 制备琯溪蜜柚红肉突变体的基因组DNA 在本实施例中，采用改良的CTAB法提取琯溪蜜柚野生型及其红肉突变体的四个组织 的基因组DNA，其四个组织分别为外果皮、中果皮、囊衣和汁胞； 2) 基因组测序 a. DNA测序文库的构建：基因组DNA的片段化、末端补平、磁珠纯化；加A即添加dAMP 到双链DNA文库片段的3'端、加接头即连接带有3' -dTMP端的双链DNA接头到文库片段； 磁珠纯化，切胶回收500bp左右大小的DNA片段；文库扩增；磁珠纯化； b. DNA文库的测序 对建好的DNA文库用Qubit 2.0测定质量浓度，用Agilent 2100生物分析仪检测插入 片段大小，用QPCR测定摩尔浓度，当质量浓度多2nM、插入片段集中且符合目的大小即可判 定文库合格，根据所需30X的数据量对各个文库取样，用hiseq2000-PE125的测序策略上机 测序； 3. SNP分析 对测序得到的野生型柚和突变型柚的各个组织数据进行质量检测，并用 Trimmomatic-O. 30去除其中低质量的部分，得到各组材料高质量的测序reads ;以甜橙基 因组为参考基因组，使用软件BWA将各组reads比对到基因组上；使用samtools/GATK进行 SNP calling和genotyping的流程，得到各组材料全基因组范围内的SNP多态性位点； 4) 突变位点挖掘 根据检测到的所有的SNP的信息，使用熵权法对SNP的QUAL、DP和MQ属性赋权值，从 而计算出各组材料各个SNP位点的Q值，用以综合衡量该处SNP的可靠性；将野生型柚和突 变型柚中的SNP的Q值进行对应比较，采用wilcoxon秩检验，并用BH法对p值进行校正， 找到野生型柚和突变型柚中Q值显著不同，即可靠的SNP位点；对上述找到的SNP位点，用 beagle软件对野生型柚和突变型柚设计case-control型的关联分析，得到突变相关的5个 候选位点； 5)相关突变位点的验证 根据5个候选SNP位点所在的序列设计特异性引物，以不同的基因组DNA为模板，用 PCR反应体系进行扩增，对所获得的扩增产物直接测序，比较各个体的PCR产物序列，验证 该目的序列，最终确定统计水平最显著的候选位点即5号染色体上的SNP位点为突变位点。
【专利摘要】本发明公开了一种基于基因组测序的体细胞突变位点挖掘方法。本发明通过对野生型柚和突变型柚的各个组织的深度重测序，对得到的高质量的测序reads和甜橙基因组进行比对获得各组材料的单核苷酸多态性位点(SNP)。基于这些全基因组分布的SNP位点，对野生型柚和突变型柚设计case-control型的关联分析，得到突变相关的候选位点，对这些候选位点进行注释，并推测性状相关变异发生的染色体区域，最后利用Sanger测序方法对候选位点进行验证，获得了突变型柚的变异位点。该方法最大的优势在于低成本、周期短。完成一个突变体突变位点挖掘的成本在2万元左右，在3个月时间内可完成，体现了基因组前沿技术和柑橘传统育种研究的结合与创新探索。本发明还公开了所述方法的开发及应用。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104946765
【申请号】CN201510357924
【发明人】徐强, 王霞, 余惠文, 温少华, 邓秀新
【申请人】华中农业大学
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年6月25日