加速引物加速PSR反应原理图。
[0088] 图4为含有两条基本引物和两条加速引物的PSR反应。
[0089] 图5为含有两条引物扩增DNA的PSR反应结果。
【具体实施方式】
[0090] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0091] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0092] 图1为自螺旋等温链式反应加速引物示意图；
[0093] 图2为自螺旋等温链式反应几种引物组合方式示意图；
[0094] 图3为加速引物加速PSR反应原理图。
[0095] 实施例1、加速聚合酶螺旋反应的引物设计
[0096] -、用于扩增靶序列的加速聚合酶螺旋反应引物设计原则
[0097] 加速聚合酶螺旋反应引物包括特异引物对和加速引物组A及加速引物组B中至少 一种；
[0098] 特异引物对由引物FP和引物BP组成，将特异引物的靶序列命名为靶序列甲；
[0099] 引物FP从5'端至3'端依次由N区域和F区域组成，F区域与靶序列甲3'末端 起15-30bp核苷酸（FC区域）相同或互补；
[0100] 引物BP从5'端至3'端依次由Ν'区域和B区域组成，B区域与靶序列甲5'末端 起15-30bp核苷酸（BC区域）互补或相同；
[0101] Ν'区域为N区域的反向不互补序列。
[0102] 引物还包括ρ对加速引物对Α，每个加速引物对A的靶序列为靶序列甲中的某个区 段，将其命名为靶区段乙，且每对加速引物对A中的上游引物和下游引物均不与F区域或B 区域重叠，P为大于等于1的整数。
[0103] 加速引物对A中的上游引物与靶区段乙自3'端15-30bp核苷酸相同或互补，加速 引物对A中的下游引物与靶区段乙自5'端15-30bp核苷酸互补或相同。
[0104] 弓丨物还包括m个加速引物对B海个加速引物对B的靶序列命名为靶片段丙，其为 靶序列甲中的某个区段；
[0105] 加速引物对B的上游引物从5'端至3'端依次由Nl区域和B-I区域组成，B-I区 域与靶片段丙3'端15-30bp核苷酸相同或互补；B-I区域不与F区域或B区域重叠；
[0106] 加速引物对B的下游引物从5'端至3'端依次由ΝΓ区域和B-2区域组成，B-2区 域与靶片段丙5'端起15-30bp核苷酸互补或相同；B-2区域不与F区域或B区域重叠；
[0107] ΝΓ区域为Nl区域的反向不互补序列；
[0108] 靶片段丙和靶片段乙相同或不同；
[0109] m为大于等于1的整数。
[0110] 靶序列BC和FC区域之间的靠近FC区域的任一区域为靶片段乙或靶片段甲靠近 3'端的部分；
[0111] 靶序列BC和FC区域之间的靠近BC区域的任一区域为靶片段乙或靶片段甲靠近 5'端的部分；
[0112] 靶序列从5'端至3'端包括Bc区域、Bcl区域、……、Bcn-I区域、Bcn区域、Fcn 区域、Fcn-I区域、......、Fcl区域、Fc区域；
[0113] P和m均大于等于1;
[0114] η大于等于2。
[0115] 二、加速聚合酶螺旋反应的体系及应用
[0116] 1、加速聚合酶螺旋反应扩增体系及反应条件
[0117] 加速聚合酶螺旋反应扩增体系为23yL PSR反应液（溶剂为水），其中各物质 浓度为：20mM Tris .HCl (pH 8. 8)，IOmM KCl，IOmM(NH4)2SO4,0.1 % Tween20,0.8M 甜菜碱 (betaine)，8mM MgSO4,1. 4mM dNTP each，8U Bst DNA 聚合酶，FP 引物、BP 引物、引物 A上和 引物A下各40pM ;
[0118] 上述加速聚合酶螺旋反应扩增体系在检测RNA时，还可以再加入8U逆转录酶。
[0119] 加速聚合酶螺旋反应扩增聚合酶螺旋反应条件：60_65°C环境中（如水浴锅、金属 浴等）进行恒温扩增反应，反应时间为120-150min。
[0120] 2、加速聚合酶螺旋反应（PSR)恒温扩增核酸的方法
[0121] 1)浊度法检测待测样品中是否含有目的基因（DNA)的方法：
[0122] (1)配制 23 μ L PSR 反应液，其中各物质浓度为：20mM Tris · HCl (pH 8. 8)，IOmM KC1，IOmM(NH4)2SO4,0.1% Tween20,0.8M 甜菜碱（betaine)，8mM MgS04,1. 4mM dNTP each， 8U Bst DNA聚合酶，加入的PSR引物量为：FP和BP各40pM ;
[0123] (2)按常规方法提取待测样品中的核酸，浓度20ng/yL以上；
[0124] (3)取2 μ L核酸提取液加入步骤（1)配制的PSR反应液中，使最终反应体积为 25 μ L，混匀反应液，加入封闭剂以防止污染；
[0125] (4)置60-65?环境中（如水浴锅、金属浴等）进行恒温扩增反应，反应时间 120-150min ；
[0126] (5)用实时浊度仪记录反应管中浊度的变化，曲线上升的样本判定为阳性结果，曲 线没有上升的样本判定为阴性结果。
[0127] 2)显色法检测待测样品中是否含有目的基因（DNA)的方法
[0128] (1)配制 23 μ L PSR 反应液，其中各物质浓度为：20mM Tris · HCl (pH 8. 8)，IOmM KC1，IOmM(NH4)2SO4,0.1% Tween20,0.8M 甜菜碱（betaine)，8mM MgS04,1. 4mM dNTP each， 8U Bst DNA聚合酶，加入的PSR引物量为：FP和BP各40pM ;
[0129] (2)按常规方法提取待测样品中的核酸，浓度20ng/yL以上；
[0130] (3)取2 μ L核酸提取液和1 μ L显色液（主要是一些可以根据反应液中Mg2+浓度 变化而产生颜色变化的金属离子指示剂，如钙黄绿素/Mn2+混合液、羟基萘酚蓝等；还包括 一些可以核酸染料，如SYBR Green I等），加入到步骤1)配制的PSR反应液中，使最终反应 体积为26 μ L，混匀反应液，加入封闭剂以防止污染；
[0131] (4)置60-65?环境中（如水浴锅、金属浴等）进行恒温扩增反应，反应时间 120-150min ；
[0132] (5)取出反应管，肉眼或紫外光辅助下观察，反应液颜色改变的样本为阳性结果， 保持颜色不变的样本为阴性结果。
[0133] 3)浊度法检测待测样品中是否含有目的RNA的方法与1)唯一的区别是，在PSR反 应液中加入8U逆转录酶；
[0134] 4)显色法检测待测样品中是否含有目的RNA的方法与2)唯一的区别是，在PSR反 应液中加入8U逆转录酶。
[0135] 实施例2、用聚合酶螺旋反应（PSR)检测待测样品中是否含有NDM-I基因以NDM-I 基因为例，用聚合酶螺旋反应（PSR)检测待测样品中是否含有目的基因（DNA)，具体方法包 括以下步骤：
[0136] 一、用于扩增NDM-I基因的加速聚合酶螺旋反应引物
[0137] 以NDM-I基因为例，用加速聚合酶螺旋反应（PSR)检测待测样品中是否含有目的 基因（DNA)，具体方法包括以下步骤：
[0138] 一、用于扩增NDM-I基因的加速聚合酶螺旋反应引物
[0139] 用NDM-I基因为范例时，PSR反应检测待测样品中是否含有NDM-I基因的方法：首 先从美国基因数据库GenBank检索获得NDM-I基因的核苷酸序列（GenBank号：FN396876)， 通过BLAST软件进行同源性分析，找到保守靶序列（序列I)，再根据其保守靶序列和上述一 的设计原则设计加速聚合酶螺旋反应引物。
[0140] 加速聚合酶螺旋反应的引物由特异引物对和1个加速引物对A组成；
[0141] 特异