引物对由引物FP和引物BP组成；
[0142] 引物 FP :从 5' -3'为 ACGATTCGTACATAGAAGTATAG-GGTCGATACCGCCTGGAC (第 1-23 位为N区域；第24-43位为F区域，F区域与靶序列第531-548位相同）（序列2)
[0143] 引物 BP :从 5 ' -3 ' 为 GATATGAAGATACATGCTTAGCA-GCATGCAGCGCGTCCA (第 1-23 位 为N区域的反向不互补片段，第24-41位为B区域，B区域与靶序列序列1第451-469位互 补）（序列3);
[0144] 加速引物对A由引物A± (序列7)和引物A下（序列8)组成，
[0145] 引物A上与靶序列上Bcl区域（靶序列序列1第531-548位核苷酸）相同，具体见 表2 ;
[0146] 引物A下与靶序列上Fcl区域（靶序列序列1第451-469位核苷酸）互补，具体见 表2 ;
[0147] 表2 NDM-I基因 PSR引物设计序列如下：
[0148]
[0149] 二、加速聚合酶螺旋反应浊度法检测待测样品中是否含有NDM-I基因的方法浓度 为56ng/ μ 1NDM-1基因水溶液作为待测样本；
[0150] 水为阴性对照；
[0151] 1、配制23yL PSR反应液，反应液中各物质浓度为：20mMTris · HCl(pH 8. 8)， 10mMKCl，10mM(NH4)2S04,0.1 % Tween20,0.8M 甜菜碱（betaine)，8mM MgS04，1.4mMdNTP each，8U Bst DNA聚合酶，加入的引物量为：FP和BP各40pM，引物A上和引物A下各20pM;
[0152] 2、按常规方法提取待测样品中的核酸；
[0153] 3、取2 μ L核酸提取液加入步骤1配制的PSR反应液中，使最终反应体积为25 μ L， 混匀反应液，加入本单位特制的封闭剂（专利【申请号】201210371448. 5)以防止气溶胶污 染；
[0154] 4、置实时浊度仪中65°C恒温90min进行PSR扩增；
[0155] 5、用实时浊度仪进行结果判读。
[0156] 扩增结果见图4,4个阳性重复（NDM-1基因水溶液）为均有浊度曲线的上升，而阴 性对照保持零浊度不变，且添加一对加速引物后反应出峰时间大幅提前。
[0157] 采用同样的方法检测，与上述区别仅在于不加入加速引物，仅有特异引物FP和 BP，结果如图5所示。
[0158] 与不添加加速引物结构比较，可以看出，不添加加速引物（图5)，PSR发生反应的 时间为85分钟，添加了加速引物后（图4)，PSR发生反应的时间为18分钟，提前了 67分 钟，说明加速引物可以大大加速PSR的反应。
【主权项】
1. 用于扩增靶序列的聚合酶螺旋反应恒温扩增核酸的引物，包括特异引物对和P对加 速引物对A ; 所述特异引物对由引物FP和引物BP组成，将所述特异引物的靶序列命名为靶序列 甲； 所述引物FP从5'端至3'端依次由N区域和F区域组成，所述F区域与所述靶序列甲 3'末端起15-30bp核苷酸相同或互补； 所述引物BP从5'端至3'端依次由N'区域和B区域组成，所述B区域与所述靶序列 甲5'末端起15-30bp核苷酸互补或相同； 所述N'区域为N区域的反向不互补序列； 每个所述加速引物对A的靶序列为所述靶序列甲中的某个区段，将其命名为靶区段 乙，且每对加速引物对A中的上游引物和下游引物均不与所述F区域或所述B区域重叠，p 为大于等于1的整数。2. 根据权利要求1所述的引物，其特征在于：所述加速引物对A中的上游引物与所述 靶区段乙自3'端15-30bp核苷酸相同或互补，所述加速引物对A中的下游引物与所述靶区 段乙自5'端15-30bp核苷酸互补或相同。3. 根据权利要求2所述的引物，其特征在于：所述引物还包括m个加速引物对B ;每个 所述加速引物对B的靶序列命名为靶片段丙，其为所述靶序列甲中的某个区段； 所述加速引物对B的上游引物从5'端至3'端依次由Nl区域和B-I区域组成，所述 B-I区域与所述靶片段丙3'端15-30bp核苷酸相同或互补；所述B-I区域不与所述F区域 或所述B区域重叠； 所述加速引物对B的下游引物从5'端至3'端依次由N1'区域和B-2区域组成，所述 B-2区域与所述靶片段丙5'端起15-30bp核苷酸互补或相同；所述B-2区域不与所述F区 域或所述B区域重叠； 所述N1'区域为Nl区域的反向不互补序列； 所述靶片段丙和所述靶片段乙相同或不同； m为大于等于1的整数。4. 根据权利要求1-3中任一所述的引物，其特征在于：所述靶序列为序列表中序列1 ; 所述引物由特异引物对和1个加速引物A对组成； 所述特异引物对中的引物FP的核苷酸序列为序列2 ; 所述特异引物对中的引物BP的核苷酸序列为序列3 ; 所述加速引物A中的引物八±的核苷酸序列为序列7 ; 所述加速引物A中的引物At的核苷酸序列为序列8。5. 用于扩增靶序列的聚合酶螺旋反应恒温扩增核酸的试剂，包括权利要求1-4中任一 所述的引物、Tris ? HC1、KC1、（NH4)2S04、Tween20、甜菜碱、MgS0 4、dNTPs 和 DNA 聚合酶； 在所述试剂中，所述引物中各条引物的摩尔比均为等比例。6. 根据权利要求5所述的试剂，其特征在于：所述试剂还包括逆转录酶。7. 用于扩增靶序列的聚合酶螺旋反应恒温扩增核酸的试剂盒，包括权利要求1-4中任 一所述的引物或权利要求5或6所述的试剂。8. 权利要求1-4中任一所述的引物或权利要求5或6所述的试剂或权利要求7所述的 试剂盒在检测待测样品中是否含有目的核酸分子中的应用； 或权利要求1-4中任一所述的引物或权利要求5或6所述的试剂或权利要求7所述的 试剂盒在制备检测待测样品中是否含有目的核酸分子产品中的应用。9. 一种检测待测样品中是否含有目的核酸分子的方法，为A或B : A包括如下步骤： 1) 提取待测样品中的核酸； 2) 以所述核酸为模板用权利要求5或6所述的试剂扩增，得到扩增反应产物； 3) 用实时浊度仪检测所述扩增反应产物，若所述扩增反应产物的实时浊度检测曲线上 升，则所述待测样本含有或候选含有所述目的核酸分子； 若所述扩增反应产物的实时浊度检测曲线没有上升，则所述待测样本不含有或候选不 含有所述目的核酸分子； B包括如下步骤： 1) 提取待测样品中的核酸； 2) 以所述核酸为模板用权利要求5或6所述的试剂扩增，且扩增时加入显色剂，得到扩 增反应产物； 3) 肉眼观察所述扩增反应产物，若所述扩增反应产物显色，则所述待测样本含有或候 选含有所述目的核酸分子； 若所述扩增反应产物不显色，则所述待测样本不含有或候选不含有所述目的核酸分 子。10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于： 所述扩增的条件为60-65°C恒温反应120-150min ; 所述核酸为DNA或RNA。
【专利摘要】本发明公开了一种加速聚合酶螺旋反应的方法及其应用。本发明提供了用于扩增靶序列的聚合酶螺旋反应的引物，包括特异引物和n个加速引物A；所述特异引物由正向引物FP和反向引物BP组成，所述正向引物FP从5’端至3’端依次由N区域和F区域组成，F区域与靶序列上靠近3’端的Fc区域相同或互补；N区域为不与F区域形成发夹结构的DNA片段；所述反向引物FP从5’端至3’端依次由B区域和所述正向引物FP中的N区域组成，B区域与靶序列上靠近5’端的Bc区域相同或互补；本发明的实验证明，本发明具有以下优点：在添加了加速引物后可以使反应时间大大缩短。
【IPC分类】C12N15/10, C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104975013
【申请号】CN201510395143
【发明人】黄留玉, 刘威, 董德荣, 邹大阳, 杨展, 黄思妺, 刘宁伟, 徐雅晴, 唐玥, 马文
【申请人】中国人民解放军疾病预防控制所, 北京安洁优科技有限公司
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年7月7日