一种猪IgG1 Fc重组杆状病毒作为猪用疫苗载体的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及一种猪IgGl Fc重组杆状病毒作为猪用疫苗 载体的制备方法。
【背景技术】
[0002] 杆状病毒（Baculovirus)是一种以昆虫为唯一宿主的病毒，可用做生物杀虫剂或 作为表达载体在昆虫细胞中大量表达外源蛋白，制备疫苗。研究发现，在哺乳动物细胞中携 带哺乳动物启动子的重组杆状病毒能启动下游外源基因的表达但病毒不能在哺乳动物细 胞中增值，对细胞毒性小，转导成功的细胞可以稳定传代并有效表达外源基因，哺乳动物细 胞比昆虫细胞对蛋白质具有更好的翻译后修饰，表达出的蛋白结构更接近天然蛋白。因此， 杆状病毒可作为一种新型的哺乳动物细胞基因转移载体，用于表达外源基因及作为一种基 因治疗载体，具有巨大潜力，日益受到人们的关注。
[0003] 杆状病毒能够进入哺乳动物体内的某些细胞，但是在这些细胞内不能进行复制。 研究人员利用这个特点将其改造为一个携带基因的工具，并进行一定的修饰加工，将其改 造成定向携带的载体，携带基因、药物到达指定的部位。但是，杆状病毒对机体来说毕竟是 一个异类，机体对它有免疫作用，这不利于病毒进入指定部位，为了解决这个问题，就在杆 状病毒基因内部引入了补体抑制分子，补体抑制分子的引入能够抑制机体对重组病毒的免 疫应答，使杆状病毒重组体在传输过程中经过血清时被消灭的危险。
[0004] 杆状病毒表面展示系统是近年发展起来的一种新型真核生物表面展示系统，因其 具有外源片段长度选择范围大，增值速度快，可以很好地保持外源蛋白的原始活性等优点， 目前已被广泛的应用于新型疫苗研制、基因转导与基因治疗、展示复杂的真核蛋白、构建多 肽文库和抗体库以及单克隆抗体的制备等领域。gp64是目前杆状病毒表面展示系统的基 础，是出芽型病毒特有的结构蛋白，也叫膜粒蛋白（peplomer protein)，成熟后嵌合在病毒 囊膜上，有二聚体、三聚体、四聚体3种存在方式。现在使用最广泛的杆状病毒展示系统是 AcMNPV和BmNPV，构建的方式是在其gp64的信号肽与成熟蛋白之间插入外源基因，外源基 因与gp64蛋白融合表达，加工后因信号肽的切除形成N端融合蛋白，这种蛋白成熟后就嵌 合在细胞膜或病毒囊膜上，这样外源基因就被表现在细胞或病毒表面，经简单筛选过程即 可得到表达有特异蛋白的杆状病毒粒子。
[0005] 口炎疱疼病毒 G 蛋白（Vesicular stomatatis virus G protein，VSVG)对于多种 不同类型和组织来源的哺乳动物细胞具有较好的通用性，能显著增强一些对杆状病毒不敏 感的哺乳动物细胞株如CH0、NIH3T3等的转导效率，然而经VSVG修饰杆状病毒后可增加细 胞毒性并促使细胞融合。随后，研究人员将VSV-GED(水泡性口炎病毒外功能区，由21个氨 基酸构成，包括跨膜区域和胞质尾区）融合表达于杆状病毒囊膜蛋白gp64,对细胞造成的 影响则可忽略不计。
[0006] 免疫球蛋白Fc不仅是决定Ig免疫功能的重要部位，而且是IgG在体内保持较长 半衰期的主要原因。由于Ig Fc具有稳定蛋白的作用，它被用来与多种蛋白融合，希望以此 增强蛋白稳定性，延长其体内半衰期。Ig Fc可形成多聚合分子，使重组蛋白具有更强的抗 原结合力，同时Ig Fc具有抗原提呈细胞受体而易被抗原提呈细胞所摄取，从而可用于提高 小分子抗原的免疫应答能力。杆状病毒表面展示Ig Fc可以增加其与抗原呈递细胞的结合。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种猪IgGl Fc重组杆状病毒作 为猪用疫苗载体的制备方法。
[0008] 本发明具体通过以下技术方案实现：一种猪IgGl Fc重组杆状病毒作为猪用疫苗 载体的制备方法，通过以下步骤完成：
[0009] 1)克隆猪IgG Fc基因和猪瘟病毒E2基因，与杆状病毒表面展示载体连接，获得重 组转移载体；
[0010] 2)重组转移载体通过Tn7转座获得重组杆状病毒Bacmid载体；
[0011] 3)重组Bacmid用脂质体方法转染昆虫细胞，收集培养物上清，获得重组杆状病 毒，观察细胞病变并提取病毒DNA做PCR鉴定；
[0012] 4)重组杆状病毒感染昆虫细胞，收集细胞做Western blot分析和共聚焦显微镜 分析；
[0013] 5)重组杆状病毒做补体拮抗活性检测；
[0014] 6)重组杆状病毒猪瘟载体在猪体做疫苗效力检验。
[0015] 所述的步骤1)中猪IgG Fc基因的序列为序列表中的SEQ ID NO: 1 ;其对应的猪 IgG Fc的氨基酸序列为SEQ ID N0:3 ;
[0016] 所述的步骤1)中猪瘟病毒E2基因的序列为序列表中的SEQ ID N0:2 ;其对应的 猪瘟病毒E2的氨基酸序列为SEQ ID N0:4。
[0017] 所述的步骤1)中猪瘟病毒E2基因的表达受CMV启动子的控制；
[0018] 所述的步骤1)中杆状病毒表面展示载体为VSVG假型化杆状病毒。
[0019] 所述的步骤2)中Bacmid载体含苜蓿银文夜蛾核型多角体病毒基因组。
[0020] 所述的步骤3)中昆虫细胞为草地夜蛾卵巢细胞sf9。
[0021] 所述的步骤4)中Western blot分析的步骤为：收集病毒感染的昆虫细胞，用细胞 裂解液处理后与蛋白上样缓冲液混合，煮沸lOmin后吸取上清做SDS-PAGE电泳；将PVDF膜 浸泡在100%甲醇中，l〇s后，移至蒸馏水洗涤5min，最后置转印缓冲液中，混匀lOmin ;蛋白 质电泳结束后，利用电转仪将蛋白质转印在PVDF膜上；将转印好的PVDF膜以含50g/L脱脂 牛乳室温封闭lh，以洗涤缓冲液清洗3次；用稀释的His标签鼠单克隆抗体4°C下摇床孵育 过夜，隔日以适量洗涤液清洗3次；加入稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，室温下摇床作 用lh后，以适量洗涤液清洗3次；用蒸馏水清洗，取出PVDF膜，稍晾干，暗房进行化学发光 反应（ECL)，等量ECL试剂I: II = 1: 1，覆盖在PVDF膜上反应lmin后，进行X光显影分析。
[0022] 所述的步骤4)中共聚焦显微镜分析的步骤为：在6孔培养板中放入无菌载玻片， 细胞先接种于无菌之载玻片上，细胞接入量为每孔加入1 X 106;细胞吸附lh后，吸弃培养 基，加入重组病毒在M0I = 10下感染；48h后吸弃培养基，再添加lmL的甲醇：丙酮=1:1 的混合液于一 20°C冰箱下固定5min，之后再加入lmL PBS缓冲液摇床转速50r/min清洗2 次，每次5min ;以lmL的20mL/L牛血清白蛋白在37°C下反应30min ;加入lmL PBS缓冲液摇 床转速50r/min清洗3次，每次5min ;接下来加入His抗体（1:100)在37°C下反应lh，以 标定表面展示的IgG Fc ;加入lmL PBS缓冲液摇床转速50r/min清洗3次后，再加入FITC 标记的兔抗鼠IgG(l: 100) 37°C下反应lh ;加入lmL PBS缓冲液摇床转速50r/min清洗3次 后，在共聚焦显微镜下观察，展示蛋白的细胞膜会被FITC染色而呈现绿色荧光。
[0023] 所述的步骤5)中补体拮抗活性检测的方法为：采健康猪前腔静脉血分离血清，血 清分为两份：一份经过56°C灭活30min，另一份不灭活；将两份血清分别与重组杆状病毒 37°C孵育60min，然后利用终点稀释法测定其病毒滴度；病毒存活率为未灭活处理组/灭活 处理组。
[0024] 所述的步骤6)中疫苗效力检验的步骤为：将抗原抗体双阴性健康猪分为4组：未 展示IgG Fc的重组杆状病毒猪瘟疫苗组：10spfu/mL重组杆状病毒2mL ;展示IgG Fc的重 组杆状病毒猪瘟疫苗组：10spfu/mL重组杆状病毒2mL ;猪瘟兔化弱毒疫苗组：1头份/2mL ; PBS组：PBS 2mL ;免疫程序为猪群观察一周后进行免疫，免疫前和免疫后7d，14d采血进行 体液免疫和细胞免疫实验分析；观察免疫后猪群是否会出现厌食、精神沉郁、发热、颤抖、出 血、腹泻、便秘等不良反应；体液免疫分析：利用ELISA试剂盒检测抗体水平；参照0IE手册 检测中和抗体水平；细胞免疫分析：利用ELISA试剂盒检测IFN-y水平。
[0025] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0026] 本发明的一个优点在于，使用的杆状病毒表面展不载体利用VSVG的TM和 CTD(VSVG-ED)替换了 gp64的TM和CTD，提高了对哺乳动物细胞的转导效率和对血清补体 的拮抗能力；
[0027] 本发明的另一个优点在于，利用展示的pFc提高对血清补体的拮抗能力，而且有 利于与抗原呈递细胞的结合提高免疫效力；
[0028] 尤其重要的，重组杆状病毒免疫动物后无不良反应，而且可以有效的刺激产生体 液免疫和细胞免疫。
【附图说明】
[0029] 从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：
[0030] 图1.重组杆状病毒转移载体结构示意图。
[0031] 图2. Western Blot分析pFc蛋白表达结果图。
[0032] 图3.共聚焦显微镜分析pFc在细胞中的位置结果图，其中，A代表自然光图片，B 代表FITC荧光图片，C代表叠加图片。
[0033] 图4.重组病毒对血清补体灭活的拮抗作用结果图。
【具体实施方式】
[0034] 以下通过实施例及附图来进一步阐明本发明的表面展示猪IgG Fc重