应体系及反应程序如下: 引物设计
通过查阅文献和用BLAST软件分析筛选出中东呼吸综合征冠状病毒0RFla2基因片段，针对该片段的六个位点设计出LAMP引物并合成，得到如下的引物；引物设计通过LAMP专用引物设计软件完成:
FOP:GTTTGCACTTATGCCATCBOP: TCATAGACACCCATAGGTGC
FIP:ATAATAAAAGTATCATCTTCTTTTTTGCTTACTCACCACAGCBIP:CACATGTTTAGGTTTCATGTTTTTTAAGCTTAAGGTTCAAAGAGAFLP: CTTCCGGAAACACAAGTGTABLP:ACTTGCTATTTGGTGTC反应体系(反应总体积为25μ1 )
FIP/BIP1.6Mmol/L
F0P/B0P0.8Mmol/L
FLP/BLP0.2Mmol/L
10 X的Bst DNA聚合酶反应体系buffer 2.5μ? 1mM脱氧核糖核苷酸dNTPI μ?
氯化镁 25mM MgCl24.5 μ?
Bst DNA 聚合酶1.0 μ?
模板2.0 μ?
超纯水补至25 μ?
扩增反应:65°C水浴20-60分钟。
[0014]检测:荧光显色:LAMP扩增的每个管中加入1.Ομ? 20XSmartgreen荧光染料混匀，在紫外灯下(波长302nm)显影。通过浊度仪获得实时的反应液中浊度的变化数据，并进行图像处理，判定结果。
[0015]本发明的优点是:方法具有简便、经济、灵敏和特异的特点，具有广阔的应用前景。
【具体实施方式】
[0016]
鉴别诊断系统的检测方法，依次按下述步骤进行:
(1)病毒RNA提取:采用传统RNA提取试剂盒提取，也可使用提取试剂盒提取；
(2)反转录:按常规反转录方法进行；
(3)LAMP反应:准备上述反应体系，将反应体系混匀，分装到0.2ml的PCR反应管中，每管23P1，PCR反应管中分别加入(2)步骤反转录的模板，每管2μ1，阳性对照品和阴性对照品个2μ1，分别作阳性对照、阴性对照，混合均匀。放入实时浊度仪或恒温水浴箱，设定反应条件:65°C，60分钟；80°C，5分钟终止反应，4°C保存，加Smartgreen荧光染料混匀，在紫外灯下显影(波长302nm)；
(4)结果判定:本发明扩增产物的检测采用浊度法。在Mg2+作用下，LAMP扩增产生的长链核酸分子能相互交联成絮状沉淀，且沉淀的量随扩增产物的增加而增加。因此实验结果的判定有如下两种方法:定性观察:在反应结束后，实验结果可以通过肉眼观察Smartgreen焚光染料在(见图
Do
[0017]实时监测:可以通过浊度仪获得实时的反应液中浊度的变化数据，并进行图像处理，判定结果(见图2)。
【附图说明】
[0018]附图1显示了 LAMP反应Smartgreen焚光染料在紫外灯下(波长302nm)显影，肉眼观察结果，左侧样品为阳性，右侧样本为阴性。
[0019]附图2显示了通过浊度仪获得实时的反应液中浊度的变化数据。1-4号为不同浓度的阳性样本，5，6号为阴性样本。
【主权项】
1.一种环介导等温扩增技术的中东呼吸综合征冠状病毒核酸检测方法，利用环介导等温扩增技术来进行，其特征在于，通过使用特异性引物，利用LAMP技术平台扩增靶基因0RFla2基因的特定区域，在阳性和阴性质控和内对照检测体系的辅助下，从分子水平对样本中的中东呼吸综合征冠状病毒进行筛查或检测。2.根据权利要求1所述的基于环介导等温扩增技术的中东呼吸综合征冠状病毒核酸筛查方法，其特征在于所述的LAMP技术平台扩增靶基因的特定区域是指中东呼吸综合征冠状病毒0RFla2基因的特定靶核酸序列区域。3.根据权利要求1所述的基于环介导等温扩增技术的中东呼吸综合征冠状病毒核酸筛查方法，其特征在于所述的阴阳性对照检测体系中，阳性对照质控品为相同于扩增冠状病毒靶基因0RFla2的RNA，阴性对照质控品为不相同于扩增冠状病毒靶基因0RFla2的RNA，并使用时间分辨浊度法或Smartgreen荧光染料紫外灯下显色法同时检测阴阳对照和中东呼吸综合征冠状病毒靶基因扩增产物。4.根据权利要求1所述的基于环介导等温扩增技术的中东呼吸综合征冠状病毒核酸筛查方法，其特征在于，所述的特异性引物为:FOP:GTTTGCACTTATGCCATCBOP: TCATAGACACCCATAGGTGCFIP:ATAATAAAAGTATCATCTTCTTTTTTGCTTACTCACCACAGCBIP:CACATGTTTAGGTTTCATGTTTTTTAAGCTTAAGGTTCAAAGAGAFLP: CTTCCGGAAACACAAGTGTABLP:ACTTGCTATTTGGTGTC。5.根据权利要求1所述的基于环介导等温扩增技术的中东呼吸综合征冠状病毒核酸筛查方法，其特征在于，所用的LAMP反应体系是由下述一系列通过优化的反应成分组成: FIP/BIP0.2-2Mmol/L F0P/B0P0.l-lMmol/L FLP/BLP0.l-lMmol/L .10 X的Bst DNA聚合酶反应体系buffer2.5μ? .1mM脱氧核糖核苷酸dNTP0.5-1.5 μ? 氯化镁 25mM MgCl24.5 μ? Bst DNA 聚合酶1.0 μ?模板2.0 μ?超纯水补至25 μ?。
【专利摘要】本发明涉及一种中东呼吸综合征冠状病毒ORF1a2基因检测试剂盒，基于由环介导等温扩增技术的中东呼吸综合征冠状病毒检测方法。是一种基于环介导等温扩增技术原理对样本中中东呼吸综合征冠状病毒ORF1a2基因进行核酸检测。通过使用特异性引物，利用环介导等温扩增技术平台扩增靶基因ORF1a2，在一系列和内对照检测体系的辅助下，从分子水平对样本中的中东呼吸综合征冠状病毒进行筛查或检测。本发明的方法具有简便、经济、快速、灵敏和特异的特点，克服了现有技术费时费力成本高的缺陷，具有广阔的应用前景。
【IPC分类】C12Q1/68, C12R1/93, C12Q1/70
【公开号】CN105039598
【申请号】CN201510501378
【发明人】张文超, 孙嘉鹏, 赵赫
【申请人】黑龙江博腾生物科技有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年8月14日