、 β5Η6、A3B5-BsAb双特异性抗体的结合抗原表位，由图3 (A)和图3 (B)可知，A3D5及β 5H6分别 结合在构象表位区段匕和P 2, A3B5-BsAb双特异性抗体结合于构象表位区段P2、P3位置，表 明该抗体能够结合双表位。
[0051 ] 实施例四、双特异性抗体A3B5-BsAb体外中和HBV活性的鉴定
[0052] 近几十年，对HBV体外感染模型研究进展缓慢，主要以黑猩猩为宿主的HBV体内感 染模型因价格昂贵和较难获得，一直阻碍HBV深入研究 [11]。近年来，随着H印aRG细胞系的 建立，对HBV的研究有较大进展[12]。H印aRG细胞系是当前唯一被公认的HBV体外感染模 型。因此，我们采用IfepaRG细胞测定A 3D5单克隆抗体的中和HBV感染H印aRG细胞的能力， 综合HBsAg及HBV DNA拷贝数定量检测分析了 A3D5单克隆抗体的中和HBV能力。
[0053] -、抗体A3B5-BsAb影响HBsAg定量检测
[0054] 用William's E medium培养H印aRG细胞，加入2% DMSO培养四周，每三天换液。 四周后，诱导分化好的IfepaRG细胞呈现典型的肝细胞样小簇，并从非分化的H印aRG细胞 中分离出来，DMSO诱导继续培养两周后，细胞约有一半呈现肝细胞样变化。诱导分化好的 HepaRG 细胞继续用含有10%胎牛血清 William's E medium 100units/mL 青霉素、IOOyg/ mL链霉素、5g/mL重组人胰岛素、5X 105mol/L氢化可的松钠盐继续培养，备用。
[0055] 纯化并除菌的抗HBsAg单克隆抗体（1 μ g/mL)与2 X IO6HBV DNA拷贝数的病毒量 室温孵育1小时。加入DMSO诱导分化好的H印aRG细胞中，并加入PEG8000,终浓度为4%， 37°C孵育过夜。第二天换液，用磷酸盐缓冲液洗涤三次，加入新鲜的配制好的William's E medium，继续培养。收集感染后第6天的细胞上清，采用罗氏公司生产的电化学发光免疫分 析仪及其配套试剂产品定量检测HBsAg。
[0056] 如图4所示，感染第6天，同对照组（clgG组）相比，单克隆抗体A3D 5组以及单克 隆抗体B5H6组能够有效降低细胞上清中HBsAg的表达量，而A 3D5与B 5H6联合应用组出现较 强的协同作用，细胞上清中的HBsAg的表达量显著降低。然而双特异性抗体A 3B5-BsAb组 与A3D5、B5H 6单克隆抗体组及其联合应用组相比较，细胞培养上清中HBsAg出现极为明显下 降（*p < 0. 05)，说明该双特异性抗体A3B5-BsAb较其亲本抗体及其合用组能够更好地抑制 HBsAg的表达，为1+1 > 2的效果，进而表明其具有极强中和HBV病毒的能力。
[0057] 二、双特异性抗体A3B5-BsAb影响HBV DNA拷贝数定量检测
[0058] 按照HBV DNA荧光定量PCR试剂盒说明书检测感染后第6天的细胞中HBV DNA拷 贝数，步骤如下：
[0059] (1)准备工作：将样品处理液A置于70°C加热5-10min，融化后混匀备用；在样品 处理液B中加无水乙醇6mL，混匀备用；在样品处理液C中加无水乙醇16mL，混匀备用；在去 抑制剂中加入700 μ L灭菌DEPC处理水，溶解后混匀备用；
[0060] ⑵核酸提取：吸取20 μ L去抑制剂于0.5mL离心管中；加入100 μ L样品，用带 滤芯吸嘴反复吹打3次；加入100 μ L样品处理液Α，振荡混匀，瞬时离心数秒后置于70°C 条件下反应10min ;将作好标记的核酸提取柱放入2ml离心管中，将上一步中所有液体移入 核酸提取柱。离心1000 OrpmX Imin ;将提取柱放入一新的2mL离心管中，加入500 μ L样品 处理液Β，离心1000 OrpmX Imin ;将提取柱放入一新的2mL离心管中，加入500 μ L样品处 理液C，离心1000 OrpmX Imin ;将提取柱放入一新的2mL离心管中，离心14000rpm x Imin ; 将提取柱放入一新的2mL离心管中，小心将50uL灭菌纯水加在柱面中央，静置Imin ;离心 1000 OrpmX lmin。取2mL离心管中的收集液12 μ L做PCR反应模板。按照HBV DNA荧光定 量PCR试剂盒说明书检测荧光值。
[0061] 如图5所示，HBV感染HePaRG第6天，抗体A3D5组及B 5Η6组与对照抗体组（clgG 组）相比能够有效降低细胞中HBV DNA的拷贝数；A3D5与B 5Η6联合应用组同样出现较强的 协同作用，经其处理后HBV DNA的拷贝数有所降低；和A3D5与B5H6联合应用组相比，双特异 性抗体A 3B5-BsAb处理HePaRG细胞组后，细胞中HBV DNA的拷贝数出现极为明显的下降（*Ρ < 0. 05)，双特异性抗体A3B5-BsAb具有极优的抑制HBV DNA复制的能力。
[0062] 实施例五、双特异性抗体A3B5-BsAb抑制肝癌细胞HBsAg的释放
[0063] HBV病毒感染与原发性肝细胞癌发生之间的关系日益受到关注。1976年 Alexander等从莫桑比克一名原发性肝癌男性患者分离到一株人肝癌细胞系，命名为PLC/ PRF/5(以下简称PLC)，该细胞系能够持续稳定产生HBsAg，自报道以来，PLC已成为国际上 研究HBV与肝癌关系的一个重要实验模型。
[0064] 以此肝癌细胞模型研究抗体是否能够抑制肝癌细胞中HBsAg释放。cIg、A3D 5、B2E5、 D3F6及F 2E5抗体组分别处理PLC/RPF/5细胞，24小时后撤除抗体，代以新鲜的培养基。3、 6、12、24小时时间点，检测细胞上清中的HBsAg的含量。如图6所示，与对照组（clg组） 相比，抗体撤除后，随时间推移，A 3D5、B5H6、A3D5+B 5H6及A3B5-BsAb不同处理组中的细胞上清 中HBsAg的浓度上升幅度变缓。双特异性抗体A 3B5-BsAb处理组细胞上清中的HBsAg的含 量上升速率明显低于A3D 5、B5H6、A3D5及B 5H6联合应用处理组（*p < 0.05)，双特异性抗体 A3B5-BsAb在抑制HBsAg释放方面效果显著。
[0065] 实施例的作用与效果
[0066] 实施例提供了一种针对乙肝表面抗原蛋白的双特异性抗体A3B5-BsAb,该双特异性 抗体由抗体A3D5以及抗体B 5H6组合而成，但其中和HBV病毒的能力以及抑制HBsAg释放的 能力较单纯将抗体A3D5以及抗体B5H6联合应用更优，显现出较强的协同效果，进而可能阻止 HBV的感染相关的肝炎、肝硬化及肝癌的进程。同时，由于该抗体是从接种乙肝疫苗的志愿 者外周血中HBsAg特异的记忆性B细胞中克隆获得的全人源抗体，其具有较鼠源、嵌合及人 源化抗体更低的免疫原性。
[0067] 参考文献
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