一种枯草芽孢杆菌发酵生产2,3-丁二醇的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程技术领域，具体涉及利用一种枯草芽孢杆菌发酵生产2，3-丁二醇的方法。
【背景技术】
[0002]2，3-丁二醇是一个重要的生物基四碳平台化合物，广泛应用于化工、食品、医药、燃料及航空航天等多个领域。2，3- 丁二醇经脱水反应可以生产1，3- 丁二烯，I, 3- 丁二烯可用于合成橡胶、ABS树脂及SBS弹性体等。由于2，3- 丁二醇冰点低达_60°C，因此可以用作抗冻剂。2，3- 丁二醇还可以通过脱氢反应生成3-羟基丁酮和双乙酰，它们具有令人愉快的乳香香味，是食品工业中常用的调香剂。2，3-丁二醇脱氢还可以生产甲基乙基酮，它是一种燃料添加剂，燃烧值比乙醇还要高，同时甲基乙基酮还可以用作树脂和涂料的溶剂。2，3-丁二醇燃烧热值达到27198J/g，和乙醇(29055J/g)相当，并且具有较高的辛烷值，是一种潜在的高价值航空燃料添加剂。
[0003]2，3- 丁二醇生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法两大类，化学法主要是在高温、高压条件下，将石油裂解时得到的四碳类碳氢化合物水解产生2，3-丁二醇，工艺条件要求高，随着石油资源的日益消耗和环境问题的恶化，这种化学合成工艺将逐渐被淘汰。微生物发酵法生产2，3-丁二醇由于其原料来源方便、操作工艺简单、环境友好等一系列优点，已引起人们的广泛关注。目前，已经报道的产2，3-丁二醇菌株主要集中在Klebsiella、Enterobacter、Serratia、Bacillus 等菌属的菌株(Ji XJ et al.Microbial2,3-butaned1l product1n:A state-of-the-art review.B1technology Advances29 (2011): 351 - 364)，其中产率较高的菌种是 Klebsiella pneumoniae、Klebsiellaoxytoca、Serratia marcescens，但这两类菌都是条件致病菌，不宜工业化推广。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是公认的安全性菌株，是工业发酵中常用生产菌株。利用枯草芽孢杆菌生产2，3- 丁二醇也有报道(饶志明等，一株环境安全的以葡萄糖为底物产2，3- 丁二醇枯草芽抱杆菌的选育，中国专利，CN101851598A, 2010 ；R.Biswas et al.Enhancedproduct1n of 2,3-butaned1l by engineered Bacillus subtilis.Appl Microb1lB1technol (2012)94:651 - 658)，但产率与 K.pneumoniae、S.marcescens 等菌株相比产率较低，没有竞争优势。提供高效安全的生产2，3- 丁二醇的菌株及发酵工艺，是本领域内技术人员面临的主要问题。
【发明内容】
[0004]为解决现有技术存在的上述问题，本发明提供一种枯草芽孢杆菌发酵生产2，3-丁二醇的方法。
[0005]发明人曾经公开从自然环境中筛选到的一株产3-羟基丁酮生产菌株Bacillussubtilis SFA-H43(赵祥颖等.一株产3-羟基丁酮的芽孢杆菌及其应用.中国专利.CN103333842B, 2015)，利用该菌株发酵生产3-羟基丁酮，当发酵液中的葡萄糖浓度耗尽后继续培养3-羟基丁酮的产率会增加10-20%。在此基础上，发明人进一步的研究发现，菌株SFA-H43在利用葡萄糖进行发酵3-羟基丁酮的过程中，同时伴有2，3- 丁二醇产生，2，3- 丁二醇和3-羟基丁酮可以相互转化，发酵前期产物以2，3- 丁二醇的为主，发酵后期2，3- 丁二醇逆转化为3-羟基丁酮，当发酵液中葡萄糖耗尽后，2，3-丁二醇仍可继续转化生成3-羟基丁酮，使3-羟基丁酮产率继续增加(见附图1)。此外，发明人通过对发酵培养基及发酵过程的工艺参数的调整，实现了利用菌株SFA-H43转化葡萄糖大量积累2，3- 丁二醇的结果O
[0006]本发明的目的之一是提供一种枯草芽孢杆菌CCTCC No:M 2013181在发酵生产2，3-丁二醇主产物中的应用，本发明所使用的菌株Bacillus subtilis SFA-H43已经在申请人以往申请的专利中公开(一株产3-羟基丁酮的芽孢杆菌及其应用，授权专利号:ZL2013 10289934.7);本领域技术人员应当了解，发酵生产2，3- 丁二醇主产物是指代谢产物以2，3-丁二醇占主要比例。
[0007]本发明的另一目的是提供一种利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CCTCCNo:M 2013181以葡萄糖为原料高产2，3-丁二醇的方法。
[0008]优选的，发酵结束时控制发酵液中的葡萄糖浓度在5g/L以上；
[0009]优选的，控制发酵液中的葡萄糖浓度为当发酵液中的葡萄糖浓度降至0-10g/L时结束发酵，或当发酵液中葡萄糖浓度低于10g/L时，通过分次补加或流加的方式向发酵罐中补加葡萄糖。
[0010]本发明采用的具体技术方案如下:
[0011]⑴种子培养
[0012]该菌株在4°C冰箱保藏，使用前划线于LB培养基斜面活化，于35-38°C培养基中培养24-36h。挑取新鲜培养的斜面一环，接种于含有40-60mL种子培养基的500mL三角瓶中，摇床转速150-200r/min，培养温度35_38°C，培养时间12_16h，此为一级种子液。将培养成熟的一级种子液以1-10%的接种量接种于装有800-1200mL种子培养基的5000mL三角瓶中，培养温度35-38°C，转速为120-180r/min，培养时间为8_12h，此为二级种子液。种子培养基:葡萄糖50-100g/L，酵母膏3-8g/L，玉米浆干粉5-lOg/L，氯化钠l_5g/L，pH7.0-7.2
[0013]⑵5L发酵
[0014]5L发酵罐装液量3.0-3.5L，米用一级种子液接种，接种量5_10%。发酵条件为:温度35-38°C，搅拌转速为300-350r/min，通气量为1.5-2.0L/min，当发酵液中的葡萄糖浓度降至0-10g/L时结束发酵。5L发酵进程如附图2所示。发酵培养基:葡萄糖150-200g/L，酵母膏 5-10g/L，玉米浆干粉 5-10g/L，尿素 l_3g/L，pH6.0-6.5。
[0015](3)50L 发酵
[0016]50L发酵罐装液量33-38L，米用二级种子液接种，接种量为5-10%。发酵条件为:温度35-38°C，搅拌转速为300-350r/min，通气量为1.0-1.5m3/h。当发酵液中的葡萄糖浓度降至0-10g/L时结束发酵。发酵进程如附图3所示。发酵培养基:葡萄糖150-200g/L，酵母膏 5-10g/L，玉米楽干粉 5-10g/L，尿素 l_3g/L，pH6.0-6.5，
[0017](4)50L补料发酵
[0018]发酵罐装液量30-35L，米用二级种子液接种，接种量5_10%。发酵条件为:培养温度35-38°C，搅拌转速为300-350r/min，空气流量为1.0-1.5m3/h。当发酵液中葡萄糖浓度低10g/L时，通过分次补加或流加的方式向发酵液中补加葡萄糖50-100g/L。分次补料发酵进程如图4所示。发酵培养基:葡萄糖150-200g/L，酵母膏5-10g/L，玉米浆干粉5_10g/L，尿素l_3g/L，pH 6.0-6.5。流加葡萄糖溶液浓度70-75%，灭菌后使用。
[0019]本发明取得了以下技术效果:
[0020](I)拓展了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CCTCC No:M 2013181 的应用范围，发明人初期该菌株发现用于3-羟基丁酮的发酵生产，其产生极少量的2，3-丁二醇；由于不同的菌株，如不同的枯草芽孢杆菌，其生理生化性质和代谢种类和能力往往差异较大，其积累的主要代谢产物也有所不同，如CN101008019A所公开的枯草芽孢杆菌CGMCCN0.1869以产3-羟基丁酮为主，不产生丁二酮、2，3-丁二醇等常见副产物，CN101851598A所公开的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 6_7以产2，3-丁二醇为主；而本发明所述的菌株通过改变培养条件，即可分别实现两种不同产物的积累。
[0021](2)实现了采用安全性菌株Bacillus subtilis SFA-H43转化葡萄糖高产2，3_ 丁二醇，产率达 110-120g/L。
【附图说明】
[0022]图1菌株SFA-H43的3_羟基丁酮发酵进程
[0023]图2菌株SFA-H43的2，3~ 丁二醇发酵进程，5L发酵罐培养
[0024]图3菌株SFA-H43的2，3~ 丁二醇发酵进程，50L发酵罐培养
[0025]图4菌株SFA-H43的2，3_ 丁二醇发酵进程，50L发酵罐分批补料培养
【具体实施方式】
[0026]以下结合技术方案详细叙述本发明的具体实施例
[0027]实施例一Bacillus subtilis SFA-H43 的 5L 发酵罐培养
[0028](I)种子液的制备
[0029]从新鲜斜面接种一环至装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中，培养温度37°C，摇床转速180r/min，培养时间为12h，细胞密度(0D600)为0.68X10。种子培养基组成:葡萄糖50g/L，酵母膏5g/L，玉米楽干粉10g/L，氯化钠2g/L，pH7.0。
[0030](2)发酵培养
[0031]米用5L发酵罐进行发酵培养，装液量为3.5L，将上述培养的种子液按5%的接种量接种于发酵培养基中，通风量为1.6L/min，搅拌转速为300r/min，定时取样检测发酵液的细胞密度((?600)、葡萄糖和2，3-丁二醇浓度。发酵周期72小时。最终检测发酵液中的2，3- 丁二醇浓度为75.0g/L。发酵培养基的组成:葡萄糖160g/L，酵母膏10g/L，玉米浆干粉10g/L，尿素2g/L，灭菌前用10mol/L的氢氧化钠将pH调至6.0，115°C灭菌20min。
[0032]实施例二Bacillus subtilis SFA-H43 的 5L 发酵罐培养
[0033](I)种子液的制备
[0034]从新鲜斜面接种一环至装有60mL种子培养基的500mL三角瓶中，培养温度36°C，摇床转速180r/min，培养时间为16h，细胞密度(0D600)为0.73X10。种子培养基组成:葡萄糖80g/L，酵母膏8g/L，玉米楽干粉5g/L，氯化钠1.5g/L，pH7.0。
[0035](2)发酵培养
[0036]米用5L发酵罐进行发酵培养，装液量为3.5L，将上述培养的种子液按10 %的接种量接种于发酵培养