硝基苯甲酸 乙醇溶液_2mol/L氢氧化钾溶液（1 :1)混合溶液（临用配制），立即在日光下检视。供试 品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，分别显相同颜色的斑点。（见图 2)
[0058] 2. 2水分测定
[0059] 照《中国药典》2010年一部（附录IX H第一法），测定。结果见表2。
[0060] 表2.穿心莲药材水分测定（n = 3)
[0061]
[0062] 2. 3含量测定
[0063] 照《中国药典》2010年版一部高效液相色谱法（附录VI D)测定，色谱条件、对照品 溶液制备、供试品溶液制备同《中国药典》2010年版一部穿心莲含量测定项下。对照品及样 品HPLC色谱图见图3~8。
[0064] 2. 3.1标准曲线
[0065] 分别取上述混合对照品溶液2 y 1、5 y 1、10 y 1、15 y 1、20 y 1注入液相色谱仪，按 "2. 4. 1"项下方法测定峰面积，并以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，回归 方程见表3,图9-10。
[0066] 表3.标准曲线
[0067]
[0068] 由表3可知，脱水穿心连内醋在0. 1848~1. 848 y g范围内呈良好的线性关系，穿 心莲内酯在〇. 1964~1.946 yg范围内呈良好的线性关系。
[0069] 2. 3. 2测定结果
[0070] 穿心莲药材HPLC含量测定结果见表4。
[0071] 表4.穿心莲含量测定（n = 3)
[0072]
[0073] HPLC含量测定结果表明脱水穿心莲内酯理论塔板数为6084,穿心莲内酯理论塔 板数为4305,符合《中国药典》2010年版一部穿心莲含量测定项下规定。
[0074] 由表4可知CXL1样品穿心莲内酯与脱水穿心莲内酯含量不合格，CXL2、CXL3样品 穿心莲内酯与脱水穿心莲内酯含量均符合《中国药典》2010年版一部穿心莲含量测定项下 规定，但由于CXL2产地并不明确，不符合《关于征求加强中药提取和提取物监督管理意见 的函》相关规定，且其穿心莲内酯含量低于产地明确的CXL3样品含量，故选择CXL3样品进 行试验研究。
[0075] 3穿心莲内酯制备
[0076] 实验对穿心莲内酯提取、纯化等关键性工艺进行了系统研究。结果如下。
[0077] 3. 1穿心莲药材前处理
[0078] 将穿心莲药材粉碎成粗粉。
[0079] 3. 2提取
[0080] 3. 1. 1提取方法考察
[0081] 试验研究对比研究了适宜工业大生产的浸渍法、渗漉法、回流法3种方法对穿心 莲内酯提取效率的影响，方法及结果如下。
[0082] 浸渍法：取穿心莲药材粗粉3份，每份25g，分别加入1. 5倍量95 %乙醇浸润30分 钟。再加入5倍量95 %乙醇55°C水浴温浸2次，每次12小时，过滤，合并滤液。得浸渍提 取液。
[0083] 渗漉法：取穿心莲药材粗粉3份，每份25g，分别加入1. 5倍量95 %乙醇浸润30分 钟。以1~3ml/min速度缓慢收集渗漉液250ml (边渗漉边加95%乙醇）。得渗漉提取液。
[0084] 回流法：取穿心莲药材粗粉3份，每份25g，分别加入1. 5倍量95%乙醇浸润30分 钟。加入5倍量95%乙醇回流提取2次，每次3小时，过滤，合并滤液。得回流提取液。
[0085] 分别取上述浸渍提取液、渗漉提取液、回流提取液1ml置10ml容量瓶中，加95%乙 醇定容至刻度，取续滤液，测定各提取液中穿心莲内酯浓度，计算穿心莲内酯提出量。以穿 心莲内酯转移率为指标，考察提取方法。结果见表5。
[0086] 表5穿心莲内酯提取方法考察
[0087]
[0088] 由表5可见，采用浸渍法和渗漉法提取效果相似，回流法提取效率最高，采用回流 法进彳T试验。
[0089] 3. 2. 2提取溶剂考察
[0090] 取穿心莲药材粗粉2份，每份25g，分别加入1. 5倍量95 %乙醇和甲醇浸润30分 钟。分别加入5倍量95 %乙醇和甲醇回流提取2次，每次3小时，过滤，合并滤液，将滤液定 容至500ml。得回流提取液。结果见表6。
[0091]表6提取溶剂考察
[0092]
[0093] 由表6可见，采用95%乙醇和甲醇作为提取溶剂对穿心莲内酯提取率影响无较大 差异，考虑到采用甲醇作为提取溶剂成本较高，且甲醇残留在临床使用时有一定的安全隐 患，故选择95 %乙醇作为提取溶剂。
[0094] 3. 2. 3正交设计优化关键工艺参数
[0095] 乙醇浓度、乙醇用量、提取时间、提取次数对穿心莲内酯的提取效率有较大影响， 故选择上述4个因素分别设置3个水平，考察其对穿心莲内酯提取效率的影响，因素水平设 计见表7。
[0096] 取穿心莲药材，每份约25g，以95%乙醇作为提取溶剂，按照正交试验表进行试 验，合并滤液，滤液按照穿心莲药材含量测定方法测定穿心莲内酯含量。正交设计及结果见 表8〇
[0097] 表7试验因素水平表
[0098]
[0099] 表8正交实验结果（n = 2)
[0100]
[0101] 对正交试验结果进行方差分析，由于A因素SS值小于误差，故归于误差后再次进 行分析，结果见表9。
[0102] 表9正交试验方差分析结果
[0103]
[0104] 对正交试验进行直观分析和方差分析可知，各因素对穿心莲提取率影响顺序为 C>D>B>A，即提取次数为主要因素，提取时间为重要因素，乙醇浓度、料液比为次要因素，考 虑到低浓度乙醇提出水溶性杂质较多，故乙醇浓度选择95 %乙醇。由此得最佳提取工艺 ，即每次加入95%乙醇4倍量，回流提取3次，每次2h。
[0105] 3. 2. 4提取工艺验证试验
[0106] 取穿心莲药材粉末200g，加入4倍量95%乙醇，回流提取3次，每次2h。结果见表 10。
[0107] 表10提取工艺验证试验
[0108]
[0109] 由表10可见，工艺经优化后穿心莲内酯提取率平均为83. 28,RSD为0. 80%，表明 经优化后的工艺提取率较高，且稳定。
[0110] 3. 3纯化工艺考察
[0111] 穿心莲内酯纯化采用水沉、加活性炭回流的方法除去叶绿素等杂质，采用三氯甲 烷静置除去脱水穿心莲内酯，最后采用乙醇重结晶的方法得到穿心莲内酯结晶。
[0112] 3. 3. 1调节乙醇浓度考察
[0113]取3. 2. 4中穿心莲提取液100ml (相当于生药量9g)，加入适量蒸馏水调节乙醇浓 度分别为55%、65%、75%、85%，静置过夜后观察沉淀情况及过滤情况，并测定溶液中穿心 莲内酯含量，计算穿心莲内酯减失量。结果见表11。
[0114] 表11调节乙醇浓度考察（n = 3)
[0115]
[0116] " + "表示有沉淀析出，"+++"表示沉淀量最大，"一"表示无沉淀析出
[0117] "林，，表示可过滤，林，，表示易过滤
[0118] 由表11可见，加水调节调节乙醇浓度为55%后穿心莲内酯含量有少量降低， 65 %~95 %则无明显变化，且调节乙醇浓度为65 %时有大量沉淀析出，且过滤迅速，故选 择调节乙醇浓度为65%即可。
[0119] 3. 3. 2水沉静置时间考察
[0120] 取穿心莲药材粉末500g，按3. 2. 4中提取方法提取的穿心莲内酯提取液并测定提 取液中穿心莲内酯含量，加提取液分为3份，分别加入相当于生药6倍量蒸馏水静置，分别 于3、6、12、24、36小时取样测定其穿心莲内酯含量，计算穿心莲内酯减失量，并观察沉淀情 况。结果见表12。
[0121] 表12加水沉淀时间考察（n = 3)
[0122]
[0123] " + "表示有沉淀析出，"+++"表示沉淀量最大，"一"表示无沉淀析出
[0124] "林"表示可过滤，林"表示易过滤
[0125] 由表12可见，加水后静置36小时，沉淀完全且穿心莲内酯含量无明显变化，SP加 水后室温静置36小时即可。
[0126] 3. 3. 3活性炭脱色考察
[0127] 3. 3. 3. 1活性炭用量考察
[0128]取3. 3. 2中穿心莲提取液3份，每份500ml (相当