型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该 化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致（图2)。
[0026] 实施例2 :化合物（I )药理作用试验
[0027] -、材料和仪器
[0028] IfepG2人肝癌细胞株购自中科院生物化学与细胞生物学研究所。L02正常人肝细 胞株由复旦大学中山医院肝癌研究所馈赠。化合物（I )自制，HPLC归一化纯度大于98%。 RPMI-1640培养基、胰酶购自Gibco公司。标准小牛血清购自Biowest公司。3-(4, 5-二甲 基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（107)、二甲基亚砜（01^0)、台盼蓝〇'巧口&仙1^6)、二氯 荧光素双醋酸盐（DCFH-DA)均购自上海国药集团化学试剂有限公司。其他常用试剂均为分 析纯。
[0029] 微量天平（瑞士梅特勒-托利多，METTLRERAE2000)。普通台式离心机（上海 安亭科学仪器厂）。数显电热恒温水浴箱（上海跃进医疗机械厂，HH.W21.600S)。二氧 化碳细胞培养箱（美国FormaScientific公司）。高速冷冻离心机（美国Thermo公司， IECMICR0MAXRF)。超微量紫外分光光度计（美国 ThermoHsher 公司，NanoDrop-1000)。 紫外成像系统（上海复日科技有限公司，FR-200A)。酶联免疫检测仪，荧光分光光度计 (HitachiF2500)。
[0030] 二、试验方法
[0031] 1、细胞培养
[0032] 将细胞常规接种于含10% (体积分数）小牛血清的RPMI-1640培养基中，置于 37°C、5% 0)2浓度的培养箱中培养。
[0033] 2、化合物（I )干预培养液的配置
[0034] 将45. 44mg化合物（I )溶于10mL二甲基亚砜（DMS0)制得储备液并分别稀释2 倍、4倍，分别得到2mmol/L、4mmol/L及8mmol/L的化合物（I )应用液。进行细胞干预前， 将50 y L应用液与4950 y L常规培养液（含10 %体积分数的小牛血清）充分混合，得到化 合物（I )干预培养液（20limcil/L、40iimcil/L、80iimcil/L)〇
[0035] 3、MTT法检测细胞存活率
[0036] 取对数生长期细胞接种于96孔培养板，每孔200 y L (5 X 103细胞）。培养12h待 细胞贴壁后，弃去原培养液，加入200 yL不同浓度的化合物（I )培养液（DMS0溶解化合物 (I )后以1%体积分数与常规培养液混合，使化合物（I )终浓度为20ymol/L、40ymol/ L、80ymol/L)，每组6个平行孔。同时设6个溶剂（DMS0)对照孔。培养2处、4811、7211，每 24小时更换化合物（I )干预培养液。干预结束后，吸去培养液，向各孔加入20 y LMTT溶 液，37°C孵育4h后吸去各孔上清液，加入150 y L DMS0,置摇床上低速震荡10min，待结晶充 分溶解后，以DMS0调零，用酶联免疫检测仪在490nm处测定各孔吸光度，计算细胞存活率 (survivalrate，SR)。SR =实验组 A49。/ 对照组 A49QX 100%
[0037] 4、台盼蓝染色測定存活细胞数
[0038] 将相同数量（2X106)的细胞接种于细胞培养瓶，培养一段时间待细胞贴壁后，弃 去培养液，用PBS洗细胞两遍后，加入5mL的化合物（I )干预培养液（20ym〇l/L、40ym〇l/ L、80ymol/L)。每组三瓶细胞，同时设立三瓶溶剂（DMS0)对照。培养48h后，用0. 25%胰 酶消化细胞，收集细胞悬液，台盼蓝染色测定细胞数。
[0039] 5、DCFH-DA法测定细胞内R0S活性
[0040]将相同数量（2X106)的细胞接种于细胞培养瓶，培养一段时间待细胞贴壁后， 吸去原培养液，加入5mL化合物（I )干预培养液，继续培养48h后，弃去培养液，胰酶消 化细胞，收集细胞悬液于1. 5mLEP管中，1500rpm离心5min，弃上清，向沉淀中加入lmL DCFH-DA，吹打混匀，37°C孵育30min，加入PBS终止反应，离心收集沉淀并溶解于lmL PBS， 吹打成均匀细胞悬液，用Hitachi-F2500焚光分光光度计测定荧光值。激发波长488nm，发 射波长525nm。
[0041] 三、结果及结论
[0042] 1、细胞生长存活率
[0043] IfepG2细胞经化合物（I)干预培养24h、48h、72h后，低、中、高剂量组的细胞存活 率均显著低于溶剂对照组（P〈〇.05)，且细胞存活率下降的程度与化合物（I)干预浓度之 间存在一定剂量效应趋势（表l，aP〈〇.05VS对照组；bP〈0.05VS低剂量组；T〈0. 05VS中剂量 组）。在同一化合物（I)干预浓度下，细胞存活率随着干预时间的增加而呈现下降的趋 势。而同等条件下，L02人正常肝细胞经化合物（I)干预后，细胞存活率无显著变化（表 2)。台盼蓝染色细胞计数结果与MTT -致（图3,aP〈0.05VS对照组；bP〈0.05VS低剂量组； CP〈0.05VS中剂量组）。
[0044] 2、细胞内R0S活性
[0045] HepG2人肝癌细胞经不同浓度化合物（I)干预后，与对照组相比，细胞内R0S水 平显著下降（P〈〇. 05)。结果见表3 (aP〈0. 05VS对照组；bP〈0. 05VS低剂量组）。
[0046] 结论，采用不同浓度的化合物（I)对人肝癌细胞IfepG2进行干预处理，经MTT比 色及台盼蓝染色细胞计数表明，化合物（I)能够有效抑制IfepG2细胞的生长增殖，干预组 细胞的存活率较对照组显著降低，且降低程度与化合物（I)浓度呈现一定的剂量效应趋 势，
[0047] 同时在同一化合物（I)浓度下，细胞存活率随着干预时间的增加而呈现持续降 低的趋势。
[0048] 与此同时，相同剂量的化合物（I)干预对L02正常肝细胞并不产生抑制作用。
[0049] 表1化合物（I)对IfepG2细胞生长存活率的影响（x土s，n= 6)
[0050]
[0051] 表2化合物（I )对L02细胞生长存活率的影响（x土 s，n = 6)
[0052]
[0053] 表3化合物（I )对IfepG2细胞R0S水平的影响（x土 s，n = 6)
[0054]
[0055]
[0056] 实施例3
[0057] 片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或 柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为 1:9的比例加入赋形剂，制粒压片。
[0058] 实施例4
[0059] 口服液的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、 或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制 成口服液。
[0060] 实施例5
[0061] 胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有机酸如 酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂 重量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
[0062]实施例6
[0063] 注射液的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、 或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精 滤，灌封灭菌制成注射液。
[0064]实施例7
[0065] 无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石 酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射 用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌 熔封得粉针剂。
【主权项】
1. 具有下述结构式的化合物（I )，2. 权利要求1所述的化合物（I )的制备方法，其特征在于包含以下操作步骤：(a)将 天葵的干燥根粉碎，用85 %乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙 酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物； (b)步骤（a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，依次用15%乙醇和75%乙醇洗脱，收集 75 %乙醇洗脱液，减压浓缩得75 %乙醇洗脱物浸膏；（c)步骤（b)中75 %乙醇洗脱浸膏用 正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、50:1、30:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱 得到5个组分；（d)步骤（c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、12:1 和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤（d)中组分2用十八烷基硅烷 键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75%的甲醇水溶液等度洗脱，收集8-10个柱体积 洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物（I )。3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树 脂。4. 药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物（I )和药学上可接 受的载体。5. 权利要求1所述的化合物（I )在制备治疗肝癌的药物中的应用。6. 权利要求4所述的药物组合物在制备治疗肝癌的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种新的二萜化合物及其制备方法和医药用途，提供了该化合物结构，含其的药物组合物及其制备方法和应用。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的二萜类化合物，可以从天葵的干燥根中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物能够有效抑制HepG2细胞的生长增殖，且降低程度与化合物(Ⅰ)浓度呈现一定的剂量效应趋势，可以用来开发成治疗肝癌的药物。
【IPC分类】A61P35/00, A61K31/365, C07D307/77
【公开号】CN105153084
【申请号】CN201510578350
【发明人】金丽秋
【申请人】金丽秋
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年9月13日