段的假病 毒颗粒的制备方法，其具体制备步骤为：
[0050](一）、重组质粒PSE380-MS2的构建：
[0051] 1、依照GenBank数据库中的MS2隧菌体基因序列（NC_001417)，自主设计用于 PCR扩增包含MS2隧菌体的包膜蛋白基因、成熟酶基因、包装信号序列的引物并人工合 成；引物为：MS2L:CCTTTCGGGGTCCTGCTC(SEQIDN0:l)MS2BglIIR:GATTAGATCTGAGTTGAACT TCTTTGTTGTCTTC(沈QIDN0:2)。
[0052] 2、应用上述引物，WMS2隧菌体基因为模版，按常规技术进行RT-PCR扩增的得到 约1780bp的产物，包含MS2隧菌体的包膜蛋白基因、成熟酶基因、包装信号序列。
[0053] 3、将扩增得到的MS2基因片段和质粒pSE380(图谱请见图1)使用限制性内切酶 化〇1和BglII分别双酶切，然后通过T4DNA连接酶将两者进行连接，得到连接产物；
[0054] 4、将上述步骤3所得到的连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞中，挑单个菌落 进行菌落PCR鉴定，将鉴定正确的单个菌落进行扩大培养并提取质粒，将重组质粒命名为 PSE380-MS2,置于-20°C保存。
[00巧](二）、重组质粒PSE380-MS2-AB的构建：
[0056] 1、根据甲型流感病毒、乙型流感病毒和P-actin的检测片段合成串联序列：
[0057]GAGGTCGAAACGTATGTTCTCTCTATCGTTCCATCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGATCGCGCAGAGACTT GAAGA(SEQIDNO:3)
[0058]CCCTGCTTGCTCGTAGTATGGTCGTTGTTAGGCCCTCTGTGGCGAGCAAAGTGGTGCTTCCCATAAGC( 沈QIDNO:4)
[0059]TGGCACCCAGCACAATGAAGATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGCAAGTACTCCGTGTGGATCGGC( 沈QIDNO:5)。
[0060] 其串联后形成的检测序列为
[0061]GAGGTCGAAACGTATGTTCTCTCTATCGTTCCATCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGATCGCGCAGAGACTT GAAGACCCTGCTTGCTCGTAGTATGGTCGTTGTTAGGCCCTCTGTGGCGAGCAAAGTGGTGCTTCCCATAAGCTGGC ACCCAGCACAATGAAGATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGCAAGTACTCCGTGTGGATCGGC(沈QIDN0:6)。
[0062] 2、自主设计并人工合成串联序列的PCR扩增引物对，序列为：
[0063]ABRF:cgggatccGAGGTCGAAACGTATGTTCTCT(SEQIDNO:7)
[0064]ABRR:ggtaaagcttctgcagggtaccagatctGCCGATCCACACGGAGTACTTG(SEQIDNO:8)〇
[0065]W上述检测序列（SEQIDNO:6)为扩增模板，按常规技术进行PCR扩增。
[0066] 3、将扩增得到的串联片段和重组质粒PSE380-MS2使用限制性内切酶Bglll和 HindllI分别双酶切，然后通过T4DNA连接酶将两者进行连接，得到连接产物。
[0067] 4、将上述步骤3所得到的连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞中，挑单个菌落分 别进行菌落PCR鉴定，将鉴定正确的单个菌落进行扩大培养并提取质粒，将重组质粒命名 为 PSE380-MS2-AB。
[0068] (S)、诱导表达与纯化：
[0069] 将上述步骤二鉴定正确的含有PSE380-MS2-AB重组质粒的阳性菌落，重新涂布于 含氨节霉素的LB固体培养基平板，挑取单菌落接种到含氨节霉素的LB液体培养基中，培养 至A600皿为0. 5-1. 0时，加入IPTG至终浓度为1.Ommol/L，继续培养36h。然后采用超声 破碎法裂解出病毒样颗粒物，向溶液中加入核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶I至终浓度均为 Img/l，37°C水浴作用化。离屯、收集上清，即为本发明含串联甲型流感病毒、乙型流感病毒和 0-actinS种检测片段的假病毒颗粒，4°C保存。
[0070] 所述得到假病毒颗粒，其是由MS2隧菌体的衣壳蛋白包裹了依次由甲型流感病 毒、乙型流感病毒和P-actinS种碱基片段（依次为沈QIDN0:3、沈QIDN0:4、沈Q IDN0:5)串联而成的检测序列（SEQIDN0:6)的DM-蛋白复合体。
[0071](四）、强阳性对照和临界阳性对照的制备：
[0072] 1、用病毒稀释液所得的病毒样颗粒进行预稀释实验，测定其CT值；
[0073] 2、根据预稀释实验，将病毒样颗粒原液进行稀释并检测；
[0074] 3、Ct值落在18. 0-21. 0之间即为强阳性对照品，稀释到Ct值落在27. 0-30. 0之 间即为临界阳性对照；
[00巧]4、220yL每管分装保存于-20°c。
[0076] 实施例2 :病毒样颗粒作为强阳性对照和临界阳性对照的均匀性测试
[0077] 取-20°C保存的强阳性对照和临界阳性对照各10支，震荡混匀离屯、后各取50uL进 行巧光PCR检测，扩增体系和扩增程序W及引物和探针如下。
[0078]RT-PCR扩增体系：
[0079]
[0080]
[0081] RT-PCR反应程序如下：
[0082]
[008引 引物和探针如下：
[0084]
[0085] 巧光PCR结果的Ct值作统计分析，评估强阳性对照和临界阳性对照的均匀性，实 验结果见附图2,数据整理如下表：
[0086]
[0087]
[008引我们采用相对标准偏差即变异系数来评价均匀性，用CV表示：
[0089] 平均值X=(Ctl+Ct2+a3+? ? ? ?+Ct9)/9
[0090] 标准差：a
[0091]
[009引 式中n为检验总数 [009引 CV=标准差/平均值
[0094] 强阳：CV(IA)=0. 1816/18. 41=0. 99%;CV(IB)=0. 26387/18. 4=1. 43% ; CV ( 0 -actin) = 0.1675/18. ：M = 0. 91 %
[0095] 临阳：CV(IA)=0. 21458/27. 84=0. 77% ;CV(IB)=0. 24436/27. 89=0. 88% ; CV(P-actin) = 0.18531/27. 94 = 0. 66%
[009引结果表明，强阳与临阳的各CV值均小于5%，各管之间差异不显著，均匀性良好。 [0097] 实施例3 :病毒样颗粒作为强阳性对照和临界阳性对照的稳定性分析 [009引不同时间点取-20°C保存的强阳性对照和临界阳性对照各3管进行巧光PCR测定， 检测方法和所用引物和探针参见实施例2。并进行统计分析各保存条件的稳定性。第1个 月取样一次，第6个月开始每月取样一次，并进行巧光PCR测定，统计分析。附图3为10月 份稳定性试验的结果图。10次稳定性试验数据结果见下表：
[0099]
[0100] 强阳性对照品检测CT值（lA)的回归方差分析：
[0101]
[0102]
[0107]
[0109] 临阳性对照品检测CT值（lA)的回归方差分析：
[0110]
[0115]显著性P〉0. 05,表明各取样时间强阳性对照和临界阳性对照变化差异不明显，14 个月内-20°C稳定性良好，故其保质期定为12个月是可行的。
[011引实施例4 :强阳性对照和临界阳性对照的应用
[0117] 一、样品材料及仪器设备：
[0118] 甲型流感病毒及乙型流感病毒核酸检测试剂盒（PCR-巧光探针法，探针和引物如 实施例2所述），5份临床样本，0. 6ml离屯、管，移液器吸头，离屯、机（配0. 6ml转子或适配 器）。推荐使用进口离屯、管和带滤忍移液器吸头进行操作，检测过程中勿使用带巧光物质的 一次性乳胶手套。
[0119] 二、核酸提取：
[0120] 核酸提取试剂：
[0121]
[0122] 所有步骤均可在室溫下进行。如离屯、机有制冷功能，请将溫度设定在25°C。详细 操作过程如下：
[0123] 1、取200iil核酸提取液A于n(n=样本数+3个外标质控品）个0.6ml离屯、管中， 每管加入5y1内标（阴性对照不用加内标）。
[0124] 2、每管分别加入待检样本、阴性对照、强阳性对照、临界阳性对照各50y1，作好标 记，充分混匀并短暂离屯、，室溫静置3分钟；
[0125] 3、每管加入200y1核酸提取液B，充分混匀，13000巧m离屯、10分钟，吸弃上清；
[0126] 4、每管加入200y1核酸提取液C，颠倒数次混匀，13000巧m离屯、5分钟，吸弃上 清，开盖在室溫或55 °C放置2~5分钟惊干；
[0127] 5、每管加入25y1样本稀释液，盖上管盖，用手指弹管底部或振荡器震荡，使核酸 充分溶解，短暂离屯、使液体全部落于管底部，冰上或4°C放置，用于RT-PCR检测。
[0128]S、RT-PCR扩增：
[0129]RT-PCR扩增甲型流感病毒、乙型流感病毒和强阳临阳对照品扩增反应，检测方法 参见实施例2。
[0130] 1、配液（在试剂准备区进行）：取出扩增反应液，室溫融化后充分混匀，短暂离屯、， 并按反应个数n(n=样本数+3个外标质控品）分别取反应液和酶按照W下配比配置反应 液：
[0131]
[0132] 计算好各试剂用量，加入适当体积于一支离屯、管中，充分混匀，短暂离屯、，然后按 20y1/管分装到透明PCR八排管或96孔PCR反应板中，转移至样本处理区；
[0133]