2、加样（在样本处理区进行）：分别加入5 步骤二中处理好的样本，盖好管盖 (透明平盖），转移至核酸扩增区；
[0134] 3、RT-PCR扩增（在核酸扩增区进行）：
[0135] 3. 1将反应管/板置于ABIPrism7500全自动巧光定量PCR仪样品槽中。
[0136] 3. 2打开仪器配置软件（Wvl. 4版本软件为例），新建文件。
[0137] 3. 3Setup窗口设置：选中所放置的样品孔，点击右键打开WellInspector窗口， 通过AddDetector按钮添加探针巧光标记信号OteporterDye:TEXASRED灯EX)/FAM/JOE S种同时勾选；如encherDye:None。其中TEX巧光指示甲型流感病毒，FAM巧光指示乙型流 感病毒，JOE巧光指示内标P-actin。）；在SampleName栏中按照对应位置输入样本信息， 在化sk栏中设置阴性对照（NTC)、未知样本OJnknow)、阳性对照OJnknow)。
[0138] 3.Alnstrument窗口 设置：
[0139] 循环条件：48°C5分钟，
[0140] 94°C2 分钟，
[0141] 94°C10 秒，55°C35 秒，40 个循环。
[014引SampleVolume设置为 25^1。
[0143] DataCollection:Stage3,St巧2 (55. 0@0 :3f5)
[0144] 3. 5保存文件，运行程序。
[0145] 四、结果分析：
[0146] 1、反应结束后立即保存数据文件。
[0147] 2、分析条件设置：根据分析后图像调节Baseline的start值，end值（可根据试 验情况自行调整，一般情况下start值可变范围在1~10,end值可变范围在5~20)。在 Linear图谱窗口设置化reshold的Value值，或者直接拉动threshold线，使得值的设置高 于背景巧光信号，且位于扩增曲线指数扩增期。选择Analyze自动分析结果。
[0148] 3、到Results/Repo;rt窗口记录样本Ct值。
[0149] 五、质量控制：
[0150] 1、阴性对照需在TEX、FAM和JOES种巧光素下巧光信号均无明显增长，并无明显 S型扩增曲线；
[0151] 2、强阳性对照需在TEX、FAM和JOES种巧光素下巧光信号均有明显增长，有典型 的S型曲线，且Ct值应在18. 00~21. 00之间；
[0152] 3、临界阳性对照需在TEX、FAM和JOES种巧光素下巧光信号均有明显增长，有典 型的S型曲线，且Ct值应在27. 00~30. 00之间。
[0153] 4、要求在同一实验中的同一巧光素下设置相同的化reshold，并满足W上S条质 控要求。否则，实验结果不成立。
[0154] 5、所有临床口咽拭子样本的内标反应都应是阳性，即Ct值小于等于35. 00,否则 该样本结果不成立。
[01巧]【参考值（参考范围）】
[0156] 通过对大量临床阴性和阳性样本的试验，利用R0C曲线法确定本试剂盒的参考Ct 值为35. 00。即待检样本的0<Ct值《35. 00为阳性，否则为阴性。35. 00《Ct值《38. 00 为试剂盒灰区，处于灰区的样本复检结果为阳性或仍处于灰区均判为阳性，符合阴性结果 判别标准则样本为阴性。
[0157]【检验结果的解释】
[0158] 综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阔值（Threshold)和基线 度aseline)，使仪器给出正确的结果。结果分析时请分别针对TEX、FAM或JOE巧光单独进 行判断。
[0159] -、质量控制分析：
[0160] 每次试验均需检测阴性质控品、强阳性对照和临界阳性对照，质控品结果满足检 验方法中质量控制要求时方可进行检测结果的判定。
[0161] 二、结果解释：
[0162] 1、阴性结果判定：待检样本无明显巧光增幅且无典型S型曲线，或待检样品TEX巧 光（甲型流感病毒）Ct〉38. 00或化det、FAM巧光（乙型流感病毒）Ct〉38. 00或化det、J0E 巧光（内标P-actin)Ct《35. 00,判定为阴性样本。
[0163] 2、阳性结果判定：巧光增幅明显，有典型S型曲线，且Ct值符合下表条件，判定为 阳性样本。
[0164]
[0165]
[0166] 3、灰区结果判定：
[0167] 巧光信号有明显增幅，但TEX巧光（Inf.A)35. 00《Ct值《 38. 00、FAM巧光（Inf. B) 35. 00《Ct值《38. 00,此处为试剂盒灰区，处于灰区的样本需复检。根据实际情况，可 重复取样或用同份样本重复检测。复检结果为阳性或仍处于灰区均判为阳性，符合阴性结 果判别标准则样本为阴性，如是内标符合阴性结果判别标准，则判定采样不合格。用同份样 本重复检测时，对样本进行适当的浓缩纯化，理论上会提高检测的灵敏度，但对灵敏度的增 加效果未验证。
[016引 4、结果示例：
[0169] 待检样本为5份临床样本，使用本试剂盒检测。检测结果包括强阳性对照、临界阳 性对照、阴性对照和临床样本5个，检测结果见附图4和附图5,数据整理为下表：
[0170]
[0171] W上所述实施例的各技术特征可W进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实 施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要运些技术特征的组合不存 在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0172] W上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干变形和改进，运些都属于本发明的保护 范围。因此，本发明专利的保护范围应W所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种假病毒颗粒，其特征在于，其是由MS2噬菌体的衣壳蛋白包裹了依次由甲型流 感病毒、乙型流感病毒和P-actin三种碱基片段串联而成的检测序列的DNA-蛋白复合体。2. 根据权利要求1所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述甲型流感病毒的碱基片段为 SEQIDN0:3或对SEQIDN0:3进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。3. 根据权利要求1所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述乙型流感病毒的碱基片段为 SEQIDN0:4或对SEQIDN0:4进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。4. 根据权利要求1-3任一项所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述P-actin的碱基片 段为SEQIDNO: 5或对SEQIDNO: 5进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸 序列。5. -种假病毒颗粒的制备方法，其特征是，包括以下步骤： (1) 使用针对MS2噬菌体基因组的引物，以MS2噬菌体基因为模板，进行RT-PCR扩增得 到产物，该扩增产物包含MS2噬菌体的包膜蛋白基因、成熟酶基因、包装信号序列； (2) 将扩增产物插入原核表达载体pSE380中，构建重组质粒pSE380-MS2 ; (3) 将所得到的重组质粒PSE380-MS2转化入大肠杆菌感受态细胞中，扩大培养，提取 质粒； (4) 得到含有依次由甲型流感病毒、乙型流感病毒和P-actin三种碱基片段串联而成 的检测序列的核苷酸序列，该核苷酸序列的两端带有限制性内切酶BglII和HindIII的酶 切位点； (5) 将步骤（4)所得到的核苷酸序列与重组质粒pSE380-MS2进行连接，构建重组质粒 PSE380-MS2-AB； (6) 诱导重组质粒pSE380-MS2-AB的表达与纯化，即得。6. 根据权利要求5所述的假病毒颗粒的制备方法，其特征是，步骤（1)中针对MS2噬菌 体基因组的引物为SEQIDNO: 1和SEQIDNO:2。7. 根据权利要求5所述的假病毒颗粒的制备方法，其特征是，步骤（4)为：用扩增引物 SEQIDNO:7和SEQIDNO:8,以SEQIDNO:6为模板进行扩增，得到的扩增产物即为所述 核苷酸序列。8. 根据权利要求5-7任一项所述的假病毒颗粒的制备方法，其特征是，步骤（6)中的诱 导表达与纯化包括以下步骤： (6. 1)、将pSE380-MS2-AB重组质粒的阳性菌落，涂布于含氨苄霉素的LB固体培养基平 板； (6. 2)、挑取单菌落接种到含氨苄霉素的LB液体培养基中； (6. 3)、培养至A600nm为0. 5-1. 0时，加入IPTG，诱导表达形成病毒颗粒； (6. 4)、采用超声破碎法裂解出病毒样颗粒物，并加入核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶I将裸露的RNA与DNA降解； (6. 5)、离心收集上清，鉴定，将鉴定正确的病毒样颗粒保存。9. 权利要求1-4任一项所述的假病毒颗粒作为甲型流感病毒和/或乙型流感病毒检测 中的外标质控品的应用。10. -种甲型流感病毒和/或乙型流感病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，包括有检测 试剂和外标质控品，所述外标质控品为权利要求1-4任一项所述的假病毒颗粒。
【专利摘要】本发明公开了一种假病毒颗粒，其是由MS2噬菌体的衣壳蛋白包裹了依次由甲型流感病毒、乙型流感病毒和β-actin三种碱基片段串联而成的检测序列的DNA-蛋白复合体。本发明还公开了上述假病毒颗粒的制备方法和其作为甲型流感病毒、乙型流感病毒检测的质控品的应用。本发明的假病毒颗粒制备方法简单、操作容易、获得的假病毒纯度高，可作为甲型流感病毒及乙型流感病毒核酸检测试剂盒中的质控品，无传染性且稳定性好，具有耐核糖核酸酶等特点。
【IPC分类】C12N15/63, C12Q1/68, C12N7/04, C12Q1/70
【公开号】CN105200018
【申请号】CN201510712786
【发明人】李小锋, 李晨阳, 崔红, 商兴芳
【申请人】广东和信健康科技有限公司, 广州呼研所生物技术有限公司
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年10月27日