一种人脐带间充质干细胞无血清培养基的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，特别是指一种人厮带间充质干细胞无血清培养基。
【背景技术】
[0002] 现有人厮带间充质干细胞培养基含有5-10%的外源动物血清，应用起来有如下不 足之处： 1) 应用中存在批间差异，需要大量的验证工作； 2) 动物血清中含促进生长的活性成分和抑制生长的成分，需测试才知对细胞生长的净 作用； 3) 血清中蛋白含量高，成分复杂，据报道不下于150种，不利于下游的分离纯化，阻碍 了细胞临床应用； 4) 外源动物血清常被病毒和支原体污染。
[0003] 综合W上，动物血清培养基给生产及科研带来许多不利因素。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明提出了一种人厮带间充质干细胞无血清培养基，具有群体倍增 时间短、细胞生长形态佳、细胞线粒体功能强的特点。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用W下技术方案予W实现： 一种人厮带间充质干细胞无血清基础培养基，包含无血清动物细胞培养基，生长因子， 细胞培养添加物，微量元素。
[0006] 进一步，所述生长因子为碱性成纤维生长因子（bFGF)，白血病抑制因子（LIF)，其 中，含量为bFGF2-15ng/ml，优选 5ng/ml，LIF5-15ng/ml，优选化g/ml。
[0007] 进一步，所述细胞培养添加物其包含：膜岛素、转铁蛋白、乙醇胺，其中，含量为膜 岛素5-20mg/L优选lOmg/L，转铁蛋白2-15mg/L优选5. 5g/L，乙醇胺0. 5-5mg/L优选 2mg/L〇
[0008] 进一步，所述微量元素为砸粉，含量为砸粉2-1化g/l，优选6. 7gn/L。
[0009] 进一步，所述无血清基础培养基为L-DMEM(低糖培养基)。
[0010] 本发明提供一种改进的人厮带间充质干细胞无血清培养基，该培养基具有（a)群 体倍增时间短，（b)细胞生长形态佳，（C)细胞线粒体功能强等特点。并且他可1.避免批间 差异和不明的血清组分对细胞培养的影响；2.避免血清的外源性污染和对细胞毒性作用； 3.是产品易于纯化，提高回收率，加速细胞治疗临床应用的进程；4.成分明确，有利于研究 细胞的生理调节机制。
【附图说明】
[0011] 图1为本发明中的培养基与市售无血清培养基在每代细胞的增殖次数对比。
[0012] 图2为本发明中的培养基对人间充质细胞培养后，在倒置显微镜下的拍照； 图3为市售无血清培养基对人间充质细胞培养后，在倒置显微镜下的拍照。
【具体实施方式】
[0013] 为让本领域的技术人员更加清晰直观的了解本发明，下面将结合附图，对本发明 作进一步的说明。
[0014] 实施例1 根据本发明公开的内容，按照W下组分和配比配置培养基1。
[001引 kDMEM，碱性成纤维生长因子5ng/ml，白血病抑制因子7ng/ml，膜岛素lOmg/L， 转铁蛋白5. 5mg/L乙醇胺2mg/L砸粉6. 7即/L。
[001引 实施例2 kDMEM，碱性成纤维生长因子2ng/ml，白血病抑制因子15ng/ml，膜岛素5mg/L转铁 蛋白15mg/l，乙醇胺0. 5mg/l，砸粉2即/L。
[0017]实施例3 kDMEM，碱性成纤维生长因子15ng/ml，白血病抑制因子5ng/ml，膜岛素20mg/l，转铁 蛋白2mg/L乙醇胺5mg/L砸粉10即/L。
[001引通过W下对比进行本发明的结果检测和对比。
[0019] 1.不同培养基培养细胞群体倍增时间比较 取厮带来源的人厮带间充质干细胞为培养对象，采用不同配方的培养基对其进行培 养，其增殖能力均从第5代研究至第15代。每代厮带间充质干细胞生长至约100%融合时， 0. 25%膜酶消化，制备成但细胞悬液，加入0. 4%台吩蓝染色2-3分钟。计算每个培养皿中细 胞总数和死亡细胞数(死亡细胞被胎盘兰染成蓝色)，取平均值，连续10代，并计算每代的平 均细胞群体倍增数目PD，绘制累计细胞群体倍增曲线，如图1所示。细胞群体倍增数目PD 由下述公式计算得出：PD= (lgNt-lgN0)/lg2,其中Nt:收集细胞数；NO:接种细胞数；t:培 养时间，本次采用的是实施例1的配比； 2. 不同培养基培养细胞后细胞生长形态比较； 采用不同配方的培养基对人厮带间充质干细胞进行培养，在倒置显微镜下拍照比较， 所得结果如图2和图3所示，其中图2为实施例1的产品，图3为市售无血清培养基； 3. 细胞线粒体功能比较； 利CellCountingKit(CCK-8)试剂盒比较经不同配方培养基培养后的细胞线粒体活 性，细胞增殖能力； 1) 在96孔板中接种细胞悬液（lOOul/孔)，向培养板中加入不同配方培养基，放在培养 箱中预培养（37°C，5%C02); 2) 向每孔加入lOulCCK-8溶液； 3) 将培养板放在培养箱内解育1-4小时； 4) 用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
[0020] 人厮带间充质干细胞用不同培养基培养后细胞的线粒体活力比较，所得结果如下 表所示：
结果表明，本发明中的培养基能够提高厮带间充质干细胞的增值能力，维持细胞的正 常形态。
[0021]W上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用W限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种人脐带间充质干细胞无血清培养基，其特征在于：包含无血清动物细胞培养 基，生长因子，细胞培养添加物，微量兀素。2. 根据权利要求1所述人脐带间充质干细胞无血清培养基，其特征在于：所述生长因 子为碱性成纤维生长因子，白血病抑制因子。3. 根据权利要求2所述人脐带间充质干细胞无血清培养基，其特征在于：所述碱性成 纤维生长因子的含量为2-15ng/ml，所述白血病抑制因子的含量为5-15ng/ml。4. 根据权利要求3所述人脐带间充质干细胞无血清培养基，其特征在于：所述碱性成 纤维生长因子的含量为5ng/ml，所述白血病抑制因子的含量为7ng/ml。5. 根据权利要求1所述人脐带间充质干细胞无血清培养基，其特征在于：所述细胞培 养添加物其包含胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺。6. 根据权利要求5所述人脐带间充质干细胞无血清培养基，其特征在于：所述细胞培 养添加物的含量为胰岛素5-20mg/L，转铁蛋白2-15mg/L，乙醇胺0. 5-5mg/L。7.根据权利要求6所述人脐带间充质干细胞无血清培养基，其特征在于：所述细胞培 养添加物的含量为胰岛素l〇mg/L，转铁蛋白5. 5mg/L，乙醇胺2mg/L。8. 根据权利要求1所述人脐带间充质干细胞无血清培养基，其特征在于：所述微量元 素为硒粉，含量为硒2-10ng/L。9. 根据权利要求1所述人脐带间充质干细胞无血清培养基，其特征在于：所述微量元 素及含量为硒粉6.7gn/L。10. 根据权利要求1所述人脐带间充质干细胞无血清培养基，其特征在于所述无血 清基础培养基为L-DMEM。
【专利摘要】本发明提出了一种人脐带间充质干细胞无血清基础培养基，包含无血清动物细胞培养基，生长因子，细胞培养添加物，微量元素，具有群体倍增时间短、细胞生长形态佳、细胞线粒体功能强的特点。
【IPC分类】C12N5/0775
【公开号】CN105200009
【申请号】CN201510666332
【发明人】曾令文, 列浦昌, 林姣
【申请人】中国科学院广州生物医药与健康研究院
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年10月15日