AGC(沈QIDN0:1)
[0035]DzT790M-2:CTGCATGAGGCTAGCTACAACGAGAGCTGCA(SEQIDN0:2)
[0036]DzTl:CATGAGGCTAGCTACAACGAGAGCTGCACG(SEQIDNO:3)
[0037]DzT2:CTGCATGAGGCTAGCTACAACGAGAGCTGCA(SEQIDN0:4)
[0038]DzT3:GGCATGAGTGTCAGCGACTCGAAGCATGATG(SEQIDNO:5)
[0039]DzT4:AGGGCATGAGTGTCAGCGACTCGAAGCAT(沈QIDN0:6)
[0040]DzT5:TGAGTGTCAGCGACTCGAAGCATGATGAG(SEQIDN0:7)
[0041] 较佳地，所述寡核巧酸具有SEQIDNO: 1或SEQIDNO: 2的序列。更佳地，所述寡 核巧酸具有SEQIDNO: 1的序列。
[0042] 上述的具体实施例主要说明针对T790M的对偶基因专一性的脱氧核糖核酸酶在 正常细胞中克服TKI抗性与降低毒性的效力。所有EGFRmRNA序列的突变能W对偶基因专 一性的方式来设计并作用。在另一具体实施例中，本发明提供一种寡核巧酸或其修饰序列， 其在细胞中专一性地杂合至EGFRE746-A750缺失的mRNA从而抑制其转译，其中所述寡核 巧酸或其修饰序列包含具有SEQIDN0:8的序列的连续核巧酸。在又一具体实施例中，本 发明提供一种寡核巧酸或其修饰序列，其在细胞中专一性地杂合至EGFRL858RmRNA从而 抑制其转译，其中所述寡核巧酸或其修饰序列包含具有选自由SEQIDN0:9至15组成的群 的序列的连续核巧酸。
[0043] 针对EGFRE746-A750缺失的脱氧核糖核酸酶：
[0044]DzEGFR_aE746A750:GGAGATGTGTCAGCTGACTCGAATGATAGCGAC(沈QIDNO: 8)
[0045] 针对EGFRL858R突变型的脱氧核糖核酸酶：
[0046]DzL858R-l:TTTGGCCAGTCAGCGACTCGAACCCAAAAT(沈QIDN0:9);
[0047]DzL858R-2:GTTTGGCCGTCAGCGACTCGAAGCCCAAAA(SEQIDN0:10);
[0048]DzL858R-3:GCCCGCCCGTCAGCGACTCGMAAATCTGT(沈QIDN0:11);
[0049]DzL858R-4:GGCCCGCCGTCAGCGACTCGAAAAAATCTG(SEQIDN0:12);
[0050]DzL858R-5:TTGGCCCGGTCAGCGACTCGAACCAAAATC(SEQIDN0:13);
[0051]DzL858R-6:CAGCAGTTGTCAGCTGACTCGAAGCCCGCCC(沈QIDN0:14);及
[0052]DzL858R-7:CCAGCAGTGTCAGCTGACTCGAAGGCCCGCC(SEQIDN0:15).
[0053] 本发明的修饰序列能根据所属领域的习知方法获得。脱氧核糖核酸酶由脱氧核 糖核酸构成，其能轻易地通过修饰，从而增进对目标RNA的可接近性（accessibility)， 增强对受质的杂合效率，增进对互补序列的分裂活性，抵抗在细胞及血流中核酸内切或 外切酵素的降解，并延长于循环系统中的血清半衰期。可行的修饰包含于核巧酸结构引 入修饰碱基，于核巧酸间引入修饰连结，W及在脱氧核糖核酸酶的5'与3'端引入官能 基。Silverman,ScottK等人指出化学修饰能通过有机合成轻易地引入7-去腺嚷岭核 碱基的C7位置及脱氧脈巧核碱基的巧位置，并且所述修饰碱基能通过适当的聚合酶简 易地并入脱氧核糖核酸酶；例如，胺修饰的脱氧腺喀晚（dA)、酪修饰的脱氧脈喀晚（加)、 咪挫修饰的脱氧脈喀晚与化晚修饰的脈喀晚扣）。（SiIverman,S.K. 2008.化talytic DNA(deoxyribozymes)forsynthetic曰pplic曰tions-currentabilitiesandfuture prospects.QiemCommun(Camb) ::3467-3485)。Schube;rt,Steffen等人指出 2, -〇-甲基修 饰W及锁核酸碱基（lockednucleicacidbase)能增强脱氧核糖核酸酶的分裂活性，所 述锁核酸碱基包含锁于C3' -endo构型的2' -0,4' -C亚甲基桥。（Schubed，S.，Gul，D. C. ,Grunert,Η.P. ,Zeichhardt,Η. ,Erdmann,V.A. ,andKurreck,J. 2003.RNA cleaving'10-23'DNAzymeswithenhancedstabilityandactivity.NucleicAcidsRes 31:5982-5992)。再者，脱氧核糖核酸酶的核巧酸间的硫代憐酸醋键（phosphorothioate bonds)、位于3'端的倒转胸腺喀晚、位于3'端的胆固醇-TEG基团、及在3'或5'端的 不同大小的阳G部分能提升于临床治疗上的可行性。0ass,C.R.,化oong,P.F. ,and Khachigian,L.Μ. 2008.DNAzymetechnologyandcancertherapy:cleaveandletdie. MolCancer化er7:243-251)。本发明提供一较佳具体实施例，其设及在两端的3个碱基 间具有硫代憐酸醋键与3'端具有胆固醇-TEG基团的脱氧核糖核酸酶。在另一实施例中， 脱氧核糖核酸酶能引入不同修饰。
[0054]本发明的寡核巧酸为能够下调EGFR突变mRNA(例如EGFRT790MmRNA、EGFR E746-A750deletionmRNA与EGFRL858RmRNA)的表达的脱氧核糖核酸酶，其能够专一性 地分裂其互补的聚核巧酸。脱氧核糖核酸酶为单股核酸剂，其能分裂单股和双股的目标序 列。度reaker'R.R.andJoyce,G.QiemistryandBiology1995 ;2:6(55,Santoro,S.W.& Joyce,G.F.Proc.化tl,Acad.Sci.USA1997 ;94:4262)。脱氧核糖核酸的一般模式（「10-23」 模式）已被提出。Schlosser,Kenny等人指出「8-17」脱氧核糖核酸酶能W0.0001至10/ min的不同反应速率在体外（invitro)单转换（single-化mover)条件下达成所有双核 巧酸组合物的分裂反应。此一特性使得合理设计的「8-17」脱氧核糖核酸酶能分裂任何其 配对的序列。此外，「10-23」脱氧核糖核酸酶仅能于嚷岭：喀晚接面（即GC、AC、GU/T、AU/ T)而非其他双核巧酸接面来执行分裂。「10-23」脱氧核糖核酸酶的鉴别选择的能力使其在 对偶基因专一性基因表达静默上成为有利的工具。灯油le1，Schlosser，K.，Gu，J.，Lam,J. C. ,andLi,Y. 2008.InvitroselectionofsmallRNA-cleavingdeoxyribozymesthat cleavepyrimidine-pyrimidinejunctions.NucleicAcidsRes36:4768-4777)。所述 催化域除了催化活性所需的核巧外，视情况地含有茎环（stem-loop)结构。在催化性脱氧 核糖核酸分子的一具体实施例中，所述催化域具有序列GGCTAGCTACAACGA(SEQIDNO: 16) 作为10-23的催化核屯、序列、GTCAGCGACTCGAA(SEQIDN0:17)作为8-17的催化核屯、序列、 GTCAGCTGACTCGAA(SEQIDN0:18)作为8-17 的催化核屯、序列及AGGAGGTAGGGGTTCCGCTC(沈Q IDNO: 19)作为两者的催化核屯、序列，并且在共通序列嚷岭：喀晚分裂mRNA。在一较佳具体 实施例中，分裂发生于EGFRT790M突变mRNA(呈现于图1B)、EGFRE746-A750缺失mRNA(呈 现于实例8第一段）W及GFRL858RmRNA(呈现于实例8第二段）中的一个或多个分裂位 点。
[0055] 常规的脱氧核糖核酸酶侧翼具有每个域为4至12个脱氧核糖核酸的两个受质辨 识域。此两个结合臂提供热稳定性及脱氧核糖核酸酶与其互补目标间的受质专一性。对于 结合臂过短的脱氧核糖核酸酶，在催化反应中脱氧核糖核酸酶与受质间交互作用的强度会 过低。在另一方面，当结合臂长度过长时，所述分裂专一性将受到影响。甚至，脱氧核糖核 酸酶结合臂的不同核巧酸组合物，会改变其对受质的杂合活性与分裂活性。对常规的脱氧 核糖核酸酶，其结合臂区的序列应与其目标受质的序列完全配对。在结合臂区中越多误配 (mismatch)，脱氧核糖核酸酶与受质间的稳定度越低。除此之外，如果所述误配位在靠近于 催化核屯、，将严重地损害催化活性。最近，Yi，化等人指出在脱氧核糖核酸酶的5'端且远 离催化核屯、12-15个碱基对处引入6个寡突出化ulge)能增进常规脱氧核糖核酸酶的效率 与专一性。（Yi,J.Z. ,andLiu,C.Q. 2011.EfficientSilencingofGeneExpressionby anASON-Bulge-DNAzymeComplex.PlosOne6)。用于分裂反应的最适当结合臂长度应基 于实验来检验。在一具体实施例中，脱氧核糖核酸酶可引入不同结合臂长度与不同突出大 小。本发明提供脱氧核糖核酸酶的对偶基因专一性静默EGFR突变mRNA。较佳地，本发明 提供脱氧核糖核酸酶的对偶基因专一性静默EGFRT790MmRNA;更佳地，本发明提供SEQID N0s:l至7。本发明也提供具有不同结合臂长度但对EGFRT790MmRNA具有相同分裂位点 的其他脱氧核糖核酸酶。基于实验的结果，SEQIDNO: 1对带有EGFRT790MmRNA的癌细 胞呈现最有效的抗增生效果。所述脱氧核糖核酸酶的细节叙述如下：
[0056] 10-23 催化核屯、序列：GGCTAGCTACAACGA(SEQIDN0:16)。
[0057] 8-17 催化核屯、序列：GTCAGCGACTCGAA(SEQ IDN0:17)。
[0058]
[0060] 在另一态样中，本发明提供包含编码本发明的核酸分子的载体。本发明另提供内 含所述载体的宿主。本发明更再提供制备所述任一个核酸分子的方法，其包含在允许细胞 表达所述核酸分子的条件下培养细胞，所述细胞中具有一载体，所述载体包含编码每一催 化性核酸分子的序列。培养细胞从而允许表达的方法与允许表达的条件为所属领域所熟 知者。例如参见Sambrook等人的「MolecularCloning:AL油oratoryManual」，Second Edition(1989)，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor,N.Y.。此 等方法能视情况地包括回收核酸产物的进一步步骤。
[0061] 本发明也提供一种医药组合物，其包含本发明的寡核巧酸或其修饰序列、载体或 宿主及医药上可接受的载剂。
[0062] 本发明的组合物能W单一药剂（单独）或进一步与EGFRTK抑制剂或EGFR 专一性抗体结合使用。所述EGFRTK抑制剂可包括任一或数个下列药物（包括它们 全部）：阿法替尼（afatinib;BIBW2992)、化647 (N-化4-二氯-2-氣苯基）-6-甲氧 基-7-(((3aR，6a巧-2-甲基八氨环戊[C]瑶咯-5-基）甲氧基）哇挫嘟-4-胺）、那替尼 (Neratinib;HKI-272)、达可替尼（dacomitinib;PF-00299804)、BMS-6690514((3R, 4时-4-胺-l-[[4-[(3-甲氧苯基）胺]化咯并巧，l-f][l，2,4]Ξ嗦-5-基]甲基]赃晚-3-醇）、 吉非替尼（gefitinib)与厄洛替尼（erlotinib)，且所述EGFR专一'性的抗体包括下列任一 或数个药物（包括它们全部）：西妥昔单抗（cetuximab)与帕尼单抗（panitumumab)。因 此，本发明的医药组合物更能包含EGFRTK抑制剂及/或EGFR专一性的抗体。
[0063] 本发明的医药组合物可根据所属领域具有通常知识者所熟悉的一般医药技术来 调配。例如，生理学可接受的载剂、赋形剂与安定剂描述于Remington'S化armaceutical Sciences, 20.sup.thEd.MackPublishingCo. (2000)。针对所欲的投药的制备物形式，可 提供各种形式的载剂。所述寡核巧酸或其修饰序列、载体、宿主与本发明组合物可被全身性 或局部地施用。在此所使用的术语"全身性"是包括皮下注射、静脉注射、肌内注射、胸骨 内注射（intrasternalinjection)、玻璃体内的注射、输注（in化sion)、吸入、经皮施用、口 月良、直肠给药W及外科手术植入（intra-ope