胞是否经历细胞调亡，针对PARP的分裂形 式进行免疫墨点分析及对憐脂结合蛋白V及PI进行免疫染色。PARP的分裂是因卡斯蛋白 酶-3(caspase-3)的活性增强所致且充当细胞调亡的标记。结果显示，当化T790M-1明显阻 断EGFR的蛋白质表达时，侦测到所分裂PARP在H1975及化97细胞中的含量比化Control 处理组增加（图4E)。虽然在经化Control转染的H1975细胞中，仅3. 6%细胞经历细胞调 亡且12. 4%细胞死亡，但在化T790M-1处理组中，侦测到18. 6%细胞为调亡细胞且32. 6% 细胞为憐脂结合蛋白V与PI双重阳性（图4F)。结果指示化T790M-1明显诱导细胞发生细 胞调亡。化97细胞中发现类似结果（图4E及4F)。与化Control处理组相比，化T790M-1 处理使整个细胞群中的调亡细胞巧.2%增至27. 4% )及死细胞（17%增至25. 1% )的百 分比显着增加。
[0121] 实例5针对T790M突变的对偶基因专一性脱氧核糖核酸酶阻断EGFR信号传导及 抑制异种移植肿瘤生长
[012引 8周龄Ba化/c裸小鼠皮下接种2X106个H1975细胞。7天后，小鼠随机分成两组 值zControl或化T790M-1)，每组由十只小鼠组成。瘤内注射与脂染胺2000混合的500皮莫 耳化Control或化T790M-1，每周两次，直至实验完成。每3至4天量测肿瘤尺寸。结果显 示，针对T790M突变的对偶基因专一性脱氧核糖核酸酶在瘤内注射之后明显抑止肿瘤生长 (图5A)。小鼠牺牲后，切除肿瘤组织且用10%福尔马林固定且嵌埋于石蜡中。异种移植肿 瘤切片用苏木素及曙红染色且用显微术加W分析。在经化T790M-1处理的肿瘤组织中侦测 到严重坏死，而化Control处理组中的肿瘤组织保持完整（图5B)。为了评估化T790M-1对 EGFR表达及下游信号传导的影响，对取自Ba化/c裸小鼠的肿瘤进行处理W便进行西方墨 点分析。结果显示，活体内异种移植肿瘤组织中的总EGFR表达、下游祀GFR、PSTAT3、ρΑΚΤ、 祀服表达受到明显抑止（图5C)。
[0123] 实例6经胆固醇修饰的针对Τ790Μ突变的对偶基因专一性脱氧核糖核酸酶及其 增强的抗增殖作用
[0124] 材料及方法
[0125] 细胞存活力分析
[0126]CL1-5巧GFR野生型）或Η1975巧GFRΤ790Μ)W每孔1X1〇5个细胞接种于12 孔盘中且培养隔夜。接着分别用具有脂染胺2000(Invitrogen)的lOOnM经胆固醇修饰 DzControl或化T790M-1处理细胞72小时。细胞用PBS缓冲液冲洗Ξ次且添加50μ1MTT 溶液（0. 5mg/mL)。在37°C培育3小时之后，用DMS0置换ΜΤΤ溶液。使用微盘读取器、依据 570nm吸光度量测细胞增殖。
[0127] 西方墨点分析
[0128]CL1-5巧GFR野生型）或H1975(EGFRT790M)W每孔3X105个细胞接种于6孔上且 培养隔夜。接着分别用具有脂染胺2000(Invit;rogen)的50nM经胆固醇修饰化Control或 化T790M-1处理细胞。经转染的化1-5细胞经血清饿乏24小时且在37°C用lOOng/mlEGF 处理15分钟。转染后72小时，收集细胞W便遵循上述程序进行西方墨点分析。分别通过 1:1000稀释的一次抗体及1:10000稀释的β-肌动蛋白检查EGFR表达及下游信号传导， 运些一次抗体针对人类祀GFR(Y1068)、巧GFR、PSTAT3 (Y7〇W、tSTAT3、ρΑΚΤ(S473)、tAKT、 祀服灯202/Y204)及巧服。
[0129] 胆固醇修饰siRNA或抗miRNA寡核巧酸（antagomirs)已证明可增强此等治疗剂 的内体逃逸能力。因此，在脱氧核糖核酸酶的3'端添加胆固醇-TEG基团（图6A)。与无 胆固醇修饰组相比，具有胆固醇修饰的脱氧核糖核酸酶通过脂染胺转染而对H1975巧GFR T790M)的抗增殖作用自50%明显增至80% (图6B)。又，此胆固醇修饰脱氧核糖核酸酶仍 保持其对偶基因专一性且不影响化1-5细胞巧GFR野生型）的细胞存活力（图6B)。此外， 与无胆固醇修饰者相比，通过半剂量投与经胆固醇修饰化T790M-1可对含T790M细胞中的 EGFR表达及下游信号传导达成对偶基因专一性抑制作用，但对野生型表达细胞则不然（图 6C及抓）。
[0130] 实例7经胆固醇修饰化T790M与阿法替尼（A化tinib) @IBW2992)的组合处理
[0131] 材料及方法
[0132]H1975W每孔3X105个细胞接种于6孔上且培养隔夜。接着分别用具有脂染胺 2000(Invitrogen)的50nM经胆固醇修饰DzControl或DZT790M-1处理细胞。同时，向培养 基中添加DMS0或lOOnMBIBW2992。转染后72小时，收集细胞W便遵循上述程序进行西方 墨点分析。分别通过1:1000稀释的一次抗体及1:10000稀释的β-肌动蛋白检查EGFR表 达及下游信号传导，运些一次抗体针对人类祀GFR灯1068)、巧GFR、PSTAT3灯705)、tSTAT3、 ρΑΚΤ(S473)、tAKT、祀服灯202/Y204)及巧服。
[0133] 细胞存活力分析
[0134] H1975W每孔lXl〇5个细胞接种于12孔盘中且培养隔夜。接着分别用具有脂 染胺2000 (Invitrogen)的50nM经胆固醇修饰DzControl或DZT790M-1与DMS0或lOOnM BIBW2992组合处理细胞72小时。细胞用PBS缓冲液冲洗Ξ次且添加50 μ 1 MTT溶液 (0. 5mg/mL)。在37°C培育3小时之后，用DMS0置换ΜΤΤ溶液。使用微盘读取器、依据570皿 吸光度量测细胞增殖。
[0135] 活体内肿瘤发生分析
[013引8周龄Ba化/c裸小鼠皮下接种2X 106个H1975细胞。10天后，小鼠随机分成W下 四组，每组由十只小鼠组成：（l)DzContro^chol+PBS，（2)DzContro^chol+BIBW2992，（3)DzT790M-1-chol+PBS，及（4)DzT790M-1-chol+BIBW2992。在经胆固醇修饰的脱氧核糖核酸 酶处理中，W每周两次的频率瘤内注射与脂染胺2000混合的500皮莫耳化Contro^chol 或DzT790M-1-chol，直至实验完成。在BIBW2992处理中，将BIBW2992悬浮于PBS中且W每 周Ξ次的频率、W每公斤小鼠20mg经口管喂投与，直至实验完成。每3至4天量测肿瘤尺 寸。所有的动物研究均根据中央研究院实验室动物中屯、批准的方案进行。
[0137] 经胆固醇修饰化T790M-1可作为单一药剂使用或进一步与其他临床药物（诸如 EGFRTKI或EGFR专一性抗体）组合使用。在本发明中，在活体外与活体内分析中均评估 经胆固醇修饰化T790M-1与阿法替尼度IBW2992)的组合处理针对T790M源抗药性的功 效。经胆固醇修饰的DZT790M明显静默总EGFR、祀GFR灯1068)及PSTAT3灯705)的表达，而 pAKT(S473)及祀服灯202/Y204)的含量稍受抑止。另一方面，BIBW2992显着抑制祀GFR、 ρΑΚΤ及祀服的表达，此时，EGFR及PSTAT3的总含量不受影响。经胆固醇修饰的化T790M 与BIBW2992的组合处理对EGFR表达及下游STAT3、AKT及邸K信号传导产生加成的抑制作 用（图7A)。此外，BIBW2992与经胆固醇修饰的化T790M的组合投与W剂量依赖方式引发 含T790M的细胞发生细胞死亡，此时EGFR野生型细胞的细胞存活力稍微受到影响（图7B)。 此外，评估组合疗法在异种移植动物模型中的可行性。与对照组相比，所有Ξ个药物处理组 的肿瘤生长速率受到不同程度的抑制。组合处理组在抑止异种移植肿瘤生长方面显示最高 效力（图7C)。总之，经胆固醇修饰的化T790M与BIBW2992的组合处理在活体外明显抑止 EGFR信号传导及含有T790M的癌细胞存活力且活体内抑制肿瘤生长。
[013引实例8针对E746-A750缺失或L858R突变的对偶基因专一性脱氧核糖核酸酶
[0139] 针对E746-A750缺失的脱氧核糖核酸酶
[0140]脱氧核糖核酸酶：DzEGFR_aEM日A75。（GGAGATGTGTCAGCTGACTCGAATGATAGCGAC;沈Q IDN0:8)是基于EGFRE746-A750缺失的W下mRNA序列设计。
[0141]
[0142] 针对L858R突变的脱氧核糖核酸酶
[0143] 基于EGFRL858R突变体的mRNA序列设计屯种脱氧核糖核酸酶。
[0144]
[0145] W下列举脱氧核糖核酸酶序列。
[014引DzL858R-l:TTTGGCCAGTCAGCGACTCGAACCCAAAAT(沈QIDN0:9);
[0147] DzL858R-2:GTTTGGCCGTCAGCGACTCGAAGCCCAAAA(SEQIDN0:10);
[0148] DzL858R-3:GCCCGCCCGTCAGCGACTCGMAAATCTGT(沈Q ID N0:11);
[0149] DzL858R-4:GGCCCGCCGTCAGCGACTCGAAAAAATCTG(SEQ ID N0:12);
[0150] DzL858R-5:TTGGCCCGGTCAGCGACTCGAACCAAAATC(SEQ ID N0:13);
[0151] DzL858R-6:CAGCAGTTGTCAGCTGACTCGAAGCCCGCCC(沈Q ID N0:14);
[0152] DzL858R-7:CCAGCAGTGTCAGCTGACTCGAAGGCCCGCC(SEQ ID NO:15)。
[0153] A549、PC9及化975细胞W每孔IXIO5个细胞接种于12孔盘中且培养隔夜。A549 及PC9细胞接着分别用具有脂染胺2000的50nM、lOOnM或150nM对照脱氧核糖核酸酶或 DzEGFR_^e74eA75。处理48小时。A549及化975细胞分别用具有脂染胺2000的lOOnM对照脱 氧核糖核酸酶或不同化L858R处理48小时。通过习知TRIzol"(InvitrogenCo巧.，Grand Island,化wYork)方法、遵循制造商方案进行RNA纯化。使用Li曲t切cler480系统 (Roche)，对40ng总mRNA进行定量型RT-PCR。PCR混合物含有5μ1 2X探针预混液、lOOnM UPL探针（RocheDia即ostics,Penzberg,Germany)及200nM引子（各者），总体积为10μ1。 PCR条件为95°C维持10分钟，随后为60轮的95°C维持10秒、60°C维持10秒及72°C维持 2秒。利用LC480软件（RocheDia即ostics)分析数据。根据ACTBmRNA校正EGFRmRNA 的相对量。PCR引子序列如下：
[0154] BGFR :正向引子:ACATCT00GMAGCCMCM(SEQID ND:24);反向引子:CTGCGTGATGAGCTGCAC(SE Q ID NO:2巧
[015引 ACIB :正向引子:ATTGGCMTGAGOGGTKXSBQIDN3:26);反向引子:GGATGCQVCAGGACTCCAT(沈Q IDNO:27)。
[015引 A549及PC9细胞W每孔1X105个细胞接种于12孔盘中且培养隔夜。接着分别用 具有脂染胺2000的50nM、lOOnM或150nM对照脱氧核糖核酸酶或化EGFR_aEMeA75。处理细 胞48小时。细胞用PBS缓冲液冲洗Ξ次且添加50μ1MTT溶液（0.5mg/mL)。在37°C培育 3小时之后，用DMS0置换MTT溶液。使用微盘读取器、依据570nm吸光度量测细胞增殖。
[0157] 实验中使用两种细胞株：A549 (野生型EGFR)及PC9 (E746-A750缺失EGFR)。对自 A549与PC9细胞中提取的EGFRmRNA测序且结果符合文献报导。侧臂序列与ΔΕ746-Α750 序列互补的化EGFR_ae74日A7日。不结合及作用于野生型EGFR。另一方面，DZEGFR_ΛΕ74日A7日。抑 止突变型EGFR表达且使得PC9细胞60%死亡，而使用DzControl处理组时，出现mRNA的 100%表达及？〔9细胞的0%死亡（图84)。4549细胞在150111脱氧核糖核酸酶存在下的 存活力稍受影响（20% )(图8B)。脱氧核糖核酸酶经高浓度脂染胺2000转染，高浓度脂染 胺2000可能使细胞中毒。然而，通过改变递送系统或修饰脱氧核糖核酸酶结构可克服此问 题。
[0158] 如图9中所示，L858R脱氧核糖核酸酶选择性地且明显地静默含有EGFR L858R突 变体的H1975细胞株中的EGFR mRNA表达。相反，L858R脱氧核糖核酸酶对A549