细胞株中 的EGFR(野生型EGFR)的mRNA表达显示很小的作用。
[0159] 实例9DzT或cDzT处理使T790M突变型细胞株中的经EGF介导的信号传导抑止
[0160] DzC或DzT转染后72小时收获化975?/lk及化97 ?/GA细胞。收获溶胞产物之前15 分钟，通过添加l(K)ng/ml EGF来活化潜在的EGF介导信号传导。
[01EGF处理后的DzC与DzT处理组均掲示H1975?/lk中的EGFR、AKT及E服的憐酸化 程度高于未经EGF处理的两个组（图10左图）。此资料指示H1975?/tK中的EGF介导信号 传导被成功活化。在此条件下，DzT对EGFR蛋白表达及下游信号传导（包括EGFR、STAT3 及邸K，但不包括AKT)仍有其抑止作用。在化97?/sa细胞株中侦测到类似结果（图10右 图）。对于经cDzT处理的H1975?ak细胞，cDzT处理可抑制在EGF处理后的EGFR蛋白表达 及下游信号传导，包括EGFR、STAT3、AKT及E服（图11)。
[0162] 实例10DzT或cDzT处理使T790M突变型细胞株中的经EGF介导的信号传导抑止
[0163]用 25nM、50nMcDzC或cDzT连同添加至培养基中的 25nM、50nM、75nM、lOOnM、 150nM、250nMBIBW-2992 或DMSO(媒剂对照）一起处理H1975 及CL97 细胞。处 理后72小时，进行MTT分析从而监测细胞存活力。使用CompuSyn3. 0. 1版软件 (ComboSyn,Inc. ,Paramus,NJ,USA)，根据Qiou-Talalay的CI方程式计算组合指数（CI) 值。
[0164]
[0165] 值山为将细胞存活力抑制X%的单独cDzT的剂量，而值X)2为将细胞存活力抑制 X%的单独BIBW-2992的剂量。值)1为cDzT的一部分且值）2为BIBW-2992的一部分，当 cDzT与BIBW-2992组合处理时，可达成X%抑制。Fa-CI图的X轴上的「所影响分率（Fa)」 表示经药物处理的细胞的细胞存活力抑制分率。CI值大于1、等于1及小于1分别指示括 抗效应、加成效应及协同效应。
[0166] 在次最佳浓度下，个别药物不能有效地抑止下游信号传导（图12)。在此浓度下， 单独cDzT主要抑制化97?/sa中的EGFR憐酸化、EGFR表达及STAT3信号传导。单独BIBW-2992 抑止化97"/64细胞中的eGFR憐酸化程度。化97 中的E服信号传导受到抑止。相比之 下，组合处理明显抑止所有下游效应子，包括STAT3、AKT及E服的憐酸化。
[0167] 结果显示BIBW-2992W浓度依赖方式增强cDzT对化975?/lk与化97 ?/GA细胞的细 胞杀死作用（图13a及13c)。对于化975?/lk，CI值为约0. 4至0. 6 (图13b)，而对于化97?/ SA，CI值为约0. 5至0. 7(图13d)。运些数据表明，cDzT与BIBW-2992的组合处理对含有 EGFRT790M突变体的细胞的细胞存活力发挥协同性抑制作用。
[016引实例11cDzT与BIBW-2992组合处理的活体内协同抗肿瘤作用
[0169] 所有的动物研究均根据中央研究院实验室动物中屯、批准的方案进行。八周龄 Ba化/c裸小鼠度ioLASCO,台湾台北）皮下接种2X106个H1975 ?/LK细胞（第0日）。在 组合处理研究中，小鼠在第10天随机分成四组且投与W下药物或药物组合：（1)cDzC，（2) cDzC+BIBW-2992，（3)cDzT，或（4)cDzT+BIBW-2992。每周两次瘤内注射与脂染胺 2000 混 合的经化ol-TEG修饰的脱氧核糖核酸酶巧00皮莫耳）。将BIBW-2992悬浮于PBS中且W 20mg/kg经口管喂、每周投与Ξ次。每3至4天使用测径器量测肿瘤的长度（L)及宽度（W)， 且肿瘤体积是依化XW2)/2计算。小鼠处死后，切除肿瘤。对较小肿瘤切片进行处理用于 免疫墨点分析且剩余肿瘤组织用10%福尔马林固定且嵌埋于石蜡中。异种移植肿瘤切片用 苏木素及曙红（H&E)、抗EGFR(对L858R突变体具专一性；CellSi即aling)及抗卡斯蛋白 酶3似9115;[即曰1;[]1邑）染色。
[0170]cDzT与BIBW-2992的协同效应亦见于异种移植动物模型中。与对照组（d)zC)相 tt，所有Ξ个药物处理组（cDzC+BIBW-2992、cDzT及cDzT+BIBW-2992)使来源于H1975?/…细 胞的肿瘤生长受到不同程度的抑制（图14a)。cDzT与BIBW-2992的组合处理在抑止异种 移植肿瘤生长的所有处理当中显示最高效力。在此群组中，所切除肿瘤的平均尺寸为对照 组的约四分之一。肿瘤组织的免疫组织化学分析显示，组合处理组的肿瘤组织出现严重坏 死，而对照组的组织则不然（图14b上图）。H1975?/tK细胞中的EGFR含有L858R与T790M 突变，且因此可使用对L858R突变形式具有专一性的抗体加W侦测。与对照组的切片相比， 组合处理组的肿瘤切片展现较低的EGFRL858R表达量伴W较高的卡斯蛋白酶-3蛋白表 达量（图14c中间及下图）。亦评估肿瘤组织中的EGFR表达及下游信号传导。结果显示， 与对照组相比，cDzT与BIBW-2992的组合进一步抑止肿瘤组织中的总EGFR表达、EGFR憐 酸化，及憐酸化形式的STAT3、AKT及E服的含量（图14d)。总之，运些结果指示，cDzT与 BIBW-2992的组合协同地抑制EGFR蛋白表达及下游信号传导，从而引发含T790M细胞经历 细胞调亡且抑止异种移植肿瘤生长。
【主权项】
1. 一种寡核苷酸或其修饰序列，其在细胞中专一性地杂合至EGFR突变mRNA从而抑制 其转译。2. 根据权利要求1的寡核苷酸或其修饰序列，其中所述EGFR突变为EGFRG719、 E746-A750 缺失、T790、L858、D761、V765 及T783。3. -种寡核苷酸或其修饰序列，其在细胞中专一性地杂合至EGFRT790MmRNA从而抑 制其转译，其中所述寡核苷酸包含具有选自由SEQIDNO: 1至7组成的群的序列的连续核 苷酸。4. 根据权利要求3的寡核苷酸或其修饰序列，其具有SEQIDNO: 1或SEQIDNO: 2的 序列。5. 根据权利要求3的寡核苷酸或其修饰序列，其具有SEQIDNO: 1。6. 根据权利要求3的寡核苷酸或其修饰序列，其中所述修饰序列包含在核苷酸结构上 的修饰碱基、核苷酸间的修饰连结或在所述寡核苷酸的5'与3'端上的官能基。7. 根据权利要求6的寡核苷酸或其修饰序列，其中所述修饰碱基包含胺修饰的脱氧腺 嘧啶、酚修饰的脱氧脲嘧啶、咪唑修饰的脱氧脲嘧啶与吡啶修饰的脲嘧啶。8. 根据权利要求3的寡核苷酸或其修饰序列，其中所述修饰序列包含在两端的3个碱 基间的硫代磷酸酯键与在3'端的胆固醇-TEG基团。9. 一种寡核苷酸或其修饰序列，其在细胞中专一性地杂合至EGFRE749-A750缺失 mRNA从而抑制其转译，其中所述寡核苷酸包含SEQIDNO:8的序列的连续核苷酸。10. 根据权利要求9的寡核苷酸或其修饰序列，其中所述修饰序列包含在核苷酸结构 上的修饰碱基、核苷酸间的修饰连结或在所述寡核苷酸的5'与3'端上的官能基。11. 根据权利要求10的寡核苷酸或其修饰序列，其中所述修饰碱基包含胺修饰的脱氧 腺嘧啶、酚修饰的脱氧脲嘧啶、咪唑修饰的脱氧脲嘧啶与吡啶修饰的脲嘧啶。12. 根据权利要求9的寡核苷酸或其修饰序列，其中所述修饰序列包含在两端的3个碱 基间的硫代磷酸酯键与在3'端的胆固醇-TEG基团。13. -种寡核苷酸或其修饰序列，其在细胞中专一性地杂合至EGFRL858RmRNA从而抑 制其转译，其中所述寡核苷酸包含具有选自由SEQIDNO: 19至15组成的群的序列的连续 核苷酸。14. 根据权利要求13的寡核苷酸或其修饰序列，其中所述修饰序列包含在核苷酸结构 上的修饰碱基、核苷酸间的修饰连结或在所述寡核苷酸的5'与3'端上的官能基。15. 根据权利要求14的寡核苷酸或其修饰序列，其中所述修饰碱基包含胺修饰的脱氧 腺嘧啶、酚修饰的脱氧脲嘧啶、咪唑修饰的脱氧脲嘧啶与吡啶修饰的脲嘧啶。16. 根据权利要求13的寡核苷酸或其修饰序列，其中所述修饰序列包含在两端的3个 碱基间的硫代磷酸酯键与在3'端的胆固醇-TEG基团。17. -种载体，其包含编码根据权利要求1-16中任一项的寡核苷酸或其修饰序列的序 列。18. -种宿主，其包含根据权利要求17的载体。19. 一种医药组合物，其包含根据权利要求1的寡核苷酸或其修饰序列以及医药上可 接受的载剂。20. 根据权利要求19的医药组合物，其更包含EGFRTK抑制剂或EGFR专一性抗体。21. 根据权利要求20的医药组合物，其中所述EGFRTK抑制剂为阿法替尼（BIBW2992)、 XL647(Ν-(3, 4-二氯-2-氟苯基）-6-甲氧基-7- (((3aR，6aS) -2-甲基八氢环戊[c]挦 咯-5-基）甲氧基）喹唑啉-4-胺）、那替尼（HKI-272)、达可替尼（PF-00299804)、BMS-66 90514((3R，4R)-4-胺-l-[[4-[(3-甲氧苯基）胺]吡咯并[2, 1-f] [1，2,4]三嗪-5-基]甲 基]哌啶-3-醇）、吉非替尼或厄洛替尼。22. 根据权利要求20的医药组合物，其中所述EGFR专一性抗体为西妥昔单抗或帕尼单 抗。23. -种在表达EGFR突变蛋白的细胞中专一性地抑制EGFR突变mRNA表达的方法， 其包含在所述细胞中使根据权利要求1-16中任一项的寡核苷酸或其修饰序列接触所述细 胞，从而专一性地抑制EGFR突变蛋白的表达。24.-种在表达EGFRT790M突变蛋白的细胞中专一性地抑制EGFRT790M突变mRNA表 达的方法，其包含在所述细胞中使根据权利要求1-8中任一项的寡核苷酸或其修饰序列接 触所述细胞，从而专一性地抑制EGFRT790M蛋白的表达。25.-种在表达EGFRT790M突变蛋白的细胞中专一性地抑制EGFRE746-A750缺失 mRNA表达的方法，其包含在所述细胞中使根据权利要求9-12中任一项的寡核苷酸或其修 饰序列接触所述细胞，从而专一性地抑制EGFRE746-A750缺失蛋白的表达。26. -种在表达EGFRT790M突变蛋白的细胞中专一性地抑制EGFRL858R突变mRNA表 达的方法，其包含在所述细胞中使根据权利要求13-16中任一项的寡核苷酸或其修饰序列 接触所述细胞，从而专一性地抑制EGFRL858R蛋白的表达。27. -种用于制备治疗个体中EGFR-依赖性癌症的药剂的用途，其中所述药剂包含有 效量的权利要求1-16中任一项的寡核苷酸或其修饰序列。28. 根据权利要求27的用途，其中所述药剂能用作手术后、放射线或化学治疗后的辅 助性治疗。29. -种用于制备治疗个体中EGFR-依赖性癌症的药剂的用途，其中所述药剂包含TKI 抑制剂或EGFR专一性抗体以及权利要求1-16中任一项的寡核苷酸或其修饰序列。30. 根据权利要求29的用途，其中所述TKI抑制剂或EGFR专一性抗体与权利要求1-16 中任一项的寡核苷酸或其修饰序列能同时地、依序地或分别地施用。31. 根据权利要求29的用途，其中所述EGFRTK抑制剂为阿法替尼（BIBW2992)、 XL647(N-(3, 4-二氯-2-氟苯基）-6-甲氧基-7- (((3aR，6aS) -2-甲基八氢环戊[c]瑪 咯-5-基）甲氧基）喹唑啉-4-胺）、那替尼（HKI-272)、达可替尼（PF-00299804)、BMS-66 90514((3R，4R)-4-胺-l-[[4-[(3-甲氧苯基）胺]吡咯并[2, 1-f] [1，2,4]三嗪-5-基]甲 基]哌啶-3-醇）、吉非替尼或厄洛替尼。32. 根据权利要求29的用途，其中所述EGFR专一性抗体为西妥昔单抗或帕尼单抗。33. 根据权利要求27或29的用途，其中所述EGFR-依赖性癌症为肺癌。34. 根据权利要求33的用途，其中所述肺癌为非小细胞肺癌。
【专利摘要】本发明提供脱氧核糖核酸酶，其能在对偶基因专一性的层级静默EGFR表达。这些抗EGFR？T790M突变的对偶基因专一性的脱氧核糖核酸酶，使EGFR？T790M？mRNA的表达减量(knockdown)同时维持EGFR野生型mRNA的完整性。因此，这些抗EGFR？T790M突变的对偶基因专一性的脱氧核糖核酸酶可克服T790M驱动的TKI抗药性并且伴随降低在肺癌病患的正常细胞中不希望的副作用。
【IPC分类】C12P19/34, A61K48/00, C12N9/00
【公开号】CN105264084
【申请号】CN201480004837
【发明人】杨泮池, 赖薇云, 白果能
【申请人】中央研究院, 杨泮池
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2014年1月14日
【公告号】CA2898200A1, EP2943578A1, US20160145625, WO2014110577A1, WO2014110577A8