发 细胞调亡及抑止异种移植的肿瘤生长。（a)肿瘤内注射（一周两次）d)zT(500微微莫耳） 及口服（一周^次）818￥-2992(20毫克/公斤）于老鼠接种化975了1/13的异种移植后的 10天（η= 7)。所述数据W平均值±标准偏差的方式呈现并且经Student'St-检定分析。 星号注记有统计上显着的差异（P<〇. 005)。化）异种移植的肿瘤组织进行免疫染色。量尺 在H&E影像中表示200微米W及在EGFRL858R及调亡蛋白酶-3影像中表示100微米。（C) 异种移植的肿瘤组织进行免疫墨点。
【具体实施方式】
[0090] 方法及材料
[0091] 细胞培养
[0092] A549巧GFR野生型）、CL1-5巧GFR野生型）、H1975巧GFR T790M)及CL97巧GFR T790M)在补充有10% (v/v)热不活化胎牛血清的RPMI-1640培养基（Gibco B化，USA)中、 在37°C及5% C〇2下培养。
[0093] 实时PCR及定量型实时PCR
[0094]A549、化1-5、H1975或化97W每孔3X105个细胞接种于6孔上且培养隔夜。接 着，分别用具有脂染胺 2000(lipofectamine2000)(Invit;rogen)的lOOnMDzControl或 化T790M-1处理细胞。48小时后，通过Mestrisol、遵循制造商方案自经脱氧核糖核酸酶处 理的细胞中提取总mRNA。使用W无规六聚物作为引子的RTIII套组（Invitrogen)来合 成cDNA。PCR引子是由GenomicsBioSci&Tech(台湾台北）合成。PCR引子序列如下所 列：
[0095]EGFR:正向引子：ACCTGCTCAACTGGTGTGTG(SEQIDN0:20);反向引子： CCAATGCCATCCACTTGATA(SEQIDNO:21)
[0096]ACTB:正向引子：TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA(SEQIDN0:22);反向引子： CGATCCACACGGAGTACTTG(SEQIDN0:23)。
[0097]PCR参数为：95°C维持10分钟，接着为25轮的如下PCR:95°C维持30秒、60°C维持 30秒及72°C维持60秒。PCR产物的电泳是使用3%琼脂糖凝胶。电泳带的强度是通过Image J定量。使用Li曲t切cler480系统（Roche)，对40ng总mRNA进行定量型RT-PCR。PCR混 合物含有 5μ1 2X探针预混液、lOOnMUPL探针（RocheDia即ostics,Penzberg,Germany)、 200nM正向引子及反向引子、0. 1μ1RNAseout及 0. 025μ1RTIII酶（Invitrogen)，总体积 为10μ1。PCR参数如下：50°C维持40分钟，接着为45轮的如下PCR:95°C维持10秒，60°C维 持 10 秒及 72°C维持 2 秒。数据通过LC480 软件（RocheDia即ostics,Penzberg,Germany) 分析。根据ACTBmRNA校正EGFRmRNA的相对量。PCR引子序列如下：
[0098]EGFR:正向引子：ACATCTCCGAAAGCCAACAA(SEQIDN0:24);反向引子： CTGCGTGATGAGCTGCAC佛QIDN0:25)。
[0099]ACTB:正向引子：ATTGGCAATGAGCGGTTC(沈QIDN0:26);反向引子： GGATGCCACAGGACTCCAT(沈QIDN0:27)。
[0100] 西方免疫墨点分析
[0101]A549、CL1-5、H1975或化97W每孔3X105个细胞接种于6孔上且培养隔夜。接着， 分别用具有脂染胺2000 (Invitrogen)的lOOnMDzControl或DZT790M-1处理细胞。经转染 的A549及化1-5细胞经血清饿乏24小时且在37°C用10化g/mlEGF处理15分钟。转染后72 小时，收集细胞用于分析。细胞用冰冷的PBS洗涂两次且接着用具有蛋白酶抑制剂（Roche) 的RIPA缓冲液提取总蛋白。来自上清液的50yg总蛋白在95°C煮沸5分钟。样品在10% SDS-PAGE凝胶上解析且转移至硝化纤维膜上。分别使用1:1000稀释的一次抗体及1:10000 稀释的β-肌动蛋白（Santa化UZ)侦测EGFR表达及下游信号传导，运些一次抗体对W下具 有专一性：人类祀GFR(Y1068)(Cellsi即aling)、tEGFR(SantaCruz)、pSTAT3(Y705)(Cell signaling)、tSTAT3(Cellsignaling)、pAKT(S473)(Cellsignaling)、tAKT(SantaCruz)、 祀服灯202/Y204)(Cellsi即aling)aE服（SantaCruz)及分裂的PARP(Cellsi即aling)。 针对兔IgG或小鼠IgG的二次抗体是W1:5000稀释度使用。膜上的蛋白质条带是通过暴 露于化学发光受质来呈像。
[0102] 细胞增殖分析
[0103]A549、化1-5、H1975或化97接种于6孔上且培养隔夜。接着，分别用具有脂染胺 2000 (Invitrogen)的lOOnMDzControl或DZT790M-1处理细胞。细胞用膜蛋白酶处理且在 转染后0小时、24小时、48小时或72小时计数。
[0104] 细胞调亡分析
[0105]H1975或化97接种于10cm盘上且培养隔夜。接着，分别用具有脂染胺 2000 (Invitrogen)的lOOnMDzControl或DZT790M-1 处理细胞。48 小时后，收集细胞，用 憐脂结合蛋白V(annexinV)及PI进行双重染色，且遵循制造商的死细胞细胞调亡套组的 方案（Invitrogen)、通过流式细胞术加W分析。
[0106] 活体内肿瘤发生分析
[0107]8周龄Ba化/c裸小鼠皮下接种2X106个H1975细胞。7天后，小鼠随机分成两组 值zControl或化T790M-1)，每组由十只小鼠组成。瘤内注射与脂染胺2000混合的500皮莫 耳（pmole)DzControl或化T790M-1，每周两次，直至实验完成。每3至4天量测肿瘤尺寸。所 有的动物研究均根据中央研究院实验室动物中屯、化油oratoryAnimalCenter,Academia Sinica)批准的方案进行。小鼠牺牲后，切除肿瘤组织且用10%福尔马林（formalin)固定 且嵌埋于石蜡中。异种移植肿瘤切片用苏木素化ematoxylin)及曙红（eosin)染色且用显 微术加W分析。
[010引统计分析
[0109] 数据W平均值+SD呈现。双侧P<0. 05的所有统计学检验均视为统计上显着的。
[0110] 实例1合成针对EGFRT790M突变的脱氧核糖核酸酶
[0111] 两种针对EGFRT790M突变的对偶基因专一性脱氧核糖核酸酶（下文中称 为化T790M-1及化T790M-2)为催化核屯、中包含15个脱氧核糖核巧酸的10-23亚型。 DZT790M的结合臂区域中的序列与含有T790M突变的EGFR的mRNA序列互补，T790M突变 为C一U核巧酸取代。在化T790M-1中，mRNA分裂位点为远离单一核巧酸突变的四核巧 酸（Abdelgany，2005)。虽然DZT790M-1的序列与含有T790M突变的mRNA完全匹配，但 化T790M-1与野生型mRNA形成一个核巧酸错配。另一方面，针对T790MmRNA、而非野生型 T790M的化T790M-2的对偶基因专一性是基于对于不同的核巧酸连结，脱氧核糖核酸酶的 反应速率不同。根据先前研究（Cairns,M.J. ,King,A.,及Sun,L.Q. 2003.Optimisationof the10-23DNAzyme-substr曰tepairinginteractionsenhancedRNAcleavageactivity atpurine-cytosinetargetsites.NucleicAcidsRes31:2883-2889),在模拟的生理条 件下，具有10-23骨架的脱氧核糖核酸酶针对AU链接展现的分裂速率高于AC链接。因此， 化T790M-2对于T790MmRNA展现的分裂速率可高于野生型mRNA。此外，对照脱氧核糖核酸 酶值zControl)的序列与人类细胞中的任何mRNA均不互补。将硫代憐酸醋键（加下划线） 引入脱氧核糖核酸酶的两端从而抵抗核酸酶降解。DNA序列如下所列（图1)。
[011引DzControl :CATCGGAGGCTAGCTACAACGAGACAGCie(SEQ ID NO :28)
[0113] DzT790M-l：AGCTGCATGAGGCTAGCTACAACGAGAGC(SEQ ID N0：1)
[0114] DzT790M-2：CTGCATGAGGCTAGCTACAACGAGAGCTGCA(SEQ ID NO：2)
[0115] 实例2针对T790M突变的对偶基因专一性脱氧核糖核酸酶使EGFRmRNA表达量衰 减
[0116] 为了检查化T790M-1的对偶基因选择性，在含有野生型EGFR的两种细胞株（A549、 化1-5)及含有EGFRT790M突变的两种细胞株化1975、化97)中侦测EGFRmRNA阻断效率。 A549、CL1-5、H1975或化97W每孔3X105个细胞接种于6孔上且培养隔夜。接着，分别用 具有脂染胺 2000(Invitrogen)的 100nMDzControl或DZT790M-1 处理细胞。48 小时后， 提取总mRNA。在图2A中，实时PCR结果显示，DZT790M-1明显静默化975及化97细胞中的 T790MEGFRmRNA表达（分别保持32%及54%mRNA表达），而野生型EGFRmRNA在A549 及 CL1-5细胞中的表达未受抑制（分别保持121 %及95%mRNA表达）。定量型实时PCR中发 现类似结果（图2B)。化T790M-1使T790MEGFRmRNA表达在H1975及化97细胞中分别降 低68. 2%及77. 4%。相比之下，在A549及CL1-5细胞中，仅1. 1 %及19. 2%的野生型EGFR mRNA表达受到影响。化T790M-1掲示对于T790MEGFRmRNA的阻断效率增加为其野生型对 应物的至少3. 5倍。
[0117] 实例3针对T790M突变的对偶基因专一性脱氧核糖核酸酶抑制总EGFR表达及下 游EGFR信号传导
[0118]EGFR属于受体酪胺酸激酶。其胞外配位体的结合引发受体二聚合、酪胺酸残基憐 酸化及下游信号传导活化，包括信号转导及转录活化因子3 (STAT3)、Akt、胞外信号调节激 酶巧服）及其他。为了检查化T790M对EGFR的蛋白质表达量及其下游信号传导的影响，对 经DZT790M转染的细胞进行西方免疫墨点分析。A549、CL1-5、H1975或CL97W每孔3X1〇5 个细胞接种于6孔上且培养隔夜。接着，分别用具有脂染胺2000(Invitrogen)的lOOnM DzControl或化T790M-1处理细胞。经转染的A549及化1-5细胞经血清饿乏24小时且在 37°C用l(K)ng/mlEGF处理15分钟。转染后72小时，收集细胞用于分析。细胞用冰冷的PBS 洗涂两次且接着用具有蛋白酶抑制剂（Roche)的RIPA缓冲液提取总蛋白。在含有野生型 EGFR的细胞株（A549及化1-5)中，在化T790M-1或化T790M-2转染之后，EGFR的蛋白质含 量与化Control组相比未降低（图3A及3B)。又，EGF处理后的下游STAT3、AKT及E服信 号传导的活化未因化T790M-1或化T790M-2转染而被抑制。相反，化T790M-1明显静默两 种EGFRT790M突变型细胞株化1975与化97)中的EGFR蛋白表达。在经化T790M-1转染 的H1975及化97细胞中，侦测到EGFR上的酪胺酸残基1068、STAT3上的酪胺酸残基705、 AKT上的丝胺酸残基473及E服化1975细胞中不存在）上的苏胺酸残基202/酪胺酸残基 204的憐酸化减少（图3C及3D)。在经化T790M-2转染的H1975细胞中发现类似结果。
[0119] 实例4针对T790M突变的对偶基因专一性脱氧核糖核酸酶诱导细胞发生细胞调 亡
[0120]EGFR及下游信号传导路径调节重要的细胞功能，包括细胞增殖及存活。为了检查 化T790M-1对细胞存活的功能性作用，分别在化Control或化T790M-1转染之后对细胞数 目进行计数。在A549及化1-5细胞巧GFR野生型）中，在化Control与化T790M-1转染组 之间，细胞增殖速率或细胞数目无异（图4A及4B)。在H1975及化97细胞巧GFRT790M) 中，经化Control转染的细胞在转染之后继续生长，此时经化T790M-1处理的细胞数目减少 (图4C及4D)。为了了解经化T790M-1处理的细