一种可同时检测果汁饮料中四种污染菌的基因快速筛查方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于果汁饮料中污染菌检测方法，特别是一种基于多重PCR技术以及毛细 管电泳分离技术，涉及一种可同时检测果汁饮料中四种污染菌的基因快速筛查方法，用于 几种常见果汁饮料中污染菌的基因快速筛选方法。
【背景技术】
[0002] 果汁是人们生活中喜爱的液体饮料之一，是以水果为原料经过物理方法如压榨、 离心、萃取等得到的汁液产品。果汁饮料，尤其是纯果汁里富含身体必需的维生素和微量元 素。随着消费者的健康意识增强，果汁饮料的消费量日益增加。
[0003] 果汁饮料生产加工过程中可能会污染一些病原微生物，在运输和储存中，暴露于 非冷藏环境会加剧污染菌的增殖，从而造成异味物质和引起果汁饮料浑浊，从而引起果汁 饮料变质，危害消费者的健康。如何能够快速、有效的检测果汁饮料中是否存在污染菌成为 本领域亟待解决的问题。
[0004] 对于果汁饮料中微生物的检测方式主要分为两类，第一类是基于培养基的传统培 养法，国内外大多数果汁饮料厂采用此类方法，但检测时间长，且只能定量不能定性到种 属，因此无法及时指导生产技术人员对果汁饮料生产过程进行监控；第二类是基于PCR技 术的分子生物学检测方法，PCR技术从核酸、基因水平极大地提高了检测效率及灵敏度，能 够定性到种、属或一类目标菌，检测快速且定性能力强，因此无论对于成品果汁饮料质量的 监控，或者生产过程问题的溯源排查，PCR技术的应用都具有广阔的前景和深远的意义，但 一次反应只能检测一类微生物。
[0005] 大量实验已证实，几种果汁饮料污染菌桔青霉Penicillium citrinum、酿酒酵母 Saccharomyces cereviseae、酉孝母菌Dekera naardenensis、黑曲霉Aspergillus niger，可 经受果汁巴氏杀菌过程而存活，从而对高温消毒处理后的果汁仍能造成危害。这几种污染 菌的鉴别是一项较复杂的工作，这些微生物需要较长的培养孵育时间，检测过程复杂，因而 有必要进行更快速的检测方法。但目前检测方法多为培养基的传统培养法，或者使用单重 PCR对每个有害菌进行逐一检测，检测成本高、耗时费力，且不能一次反应得出检测结果，不 利于大量样品的快速检测。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对现有技术的缺陷，克服果汁饮料中几种污染菌检测技术操作 繁琐，费时耗力等不足，提供一种由4对引物组成的引物体系，通过采用高通量的多重PCR 技术与高分辨率的毛细管电泳分离技术相结合的方式，从而实现对果汁饮料中是否存在污 染菌污染的检测。
[0007] 本发明的技术方案是：
[0008] 本发明针对4种污染菌对样品进行分析，若能检测出其中任一种污染菌，则说明 样品中含有具有果汁饮料污染能力的污染菌。
[0009] -种果汁饮料污染菌的快速筛查方法，采用4重PCR同时扩增4种污染菌的基 因，再通过毛细管电泳分离所述4重PCR扩增产物，所述4重PCR反应中应用引物SEQ ID NO. 1-8 〇
[0010] 本发明方法具体如下：
[0011] 步骤（1)、果汁饮料污染菌的培养及DNA模板提取：
[0012] 将检测样品在无氧环境中26°C静置过夜富集培养；通过真空栗过滤收集细胞沉 淀于滤膜上；将滤膜转移至反应试管，加入50mM EDTA 480ul再加入10mg/ml溶菌酶120ul， 37°C孵育60min，13, OOOXg离心2min，移去上清液，之后采用试剂盒提取果汁饮料污染菌 的DNA模板；
[0013] 步骤（2)、多重PCR扩增：
[0014] 将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行多重PCR扩增，得到扩增产物；
[0015] 所述的多重PCR扩增反应体系为20ul由100nM正向混合引物2ul，100nM反向混合 引物 2ul，25mM 的 MgC124ul，5 X PCRBuf f er4ul，5U/ul 的 Taq 聚合酶 0· 7ul，DNA 模板 lul，余 量的双蒸水组成；其中正向混合引物中SEQ ID NO. 1引物、SEQ ID NO. 3引物、SEQ ID NO. 5、 SEQ ID NO. 7引物的浓度比为1:1:1:1，反向混合引物中SEQ ID NO. 2引物、SEQ ID NO. 4引 物、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 8 引物的浓度比为 1:1:1:1 ;
[0016] 所述的多重PCR扩增反应的条件是95°C预变性lOmin ;以94°C 30s ;58°C 30s ; 70°C lmin为1个循环，共进行35个循环；4°C保温；
[0017] 表1本发明用于污染菌的基因检测的4重引物体系各引物序列
[0019] 步骤（3)、毛细管电泳分离条件：
[0020] 分离体系：lul所述步骤（2)中所得的扩增产物与体积含量为95%去离子甲酰胺 38. 5ul，400bpDNA MarkerO. 5ul 混合均匀；
[0021] 分尚条件：在50°C、6· 0KV电压下，分尚35min ;
[0022] 步骤（4)、检测鉴定：
[0023] 步骤（2)中所得的扩增产物经过毛细管电泳分离时，通过多重基因表达遗传分 析系统自动检索、收集样品中荧光信号判断是否在基因片段长度为160bp、192bp、201bp、 247bp相应位置处出现特征峰；若在160bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中 含有桔青霉Penicillium citrinum ;若在192bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测 样品中含有酿酒酵母Saccharomyces cereviseae ;若在201bp相应位置处出现特征峰，贝lj 判断为该检测样品中含有酵母菌Dekera naardenensis ;若在247bp相应位置处出现特征 峰，贝判断为该检测样品中含有黑曲霉Aspergillus niger。
[0024] 表2果汁饮料污染菌基因特征峰位置
[0026] 与现有技术相比本发明具有如下特点：
[0027] 其一，本发明可在同一 PCR管中进行，操作简单，能快速确定果汁饮料中是否存在 污染菌，且检测结果准确；
[0028] 其二，通过分析基因确定桔青霉Penicillium citrinum、酿酒酵母Saccharomyces cereviseae、酵母菌 Dekera naardenensis、黑曲霉 Aspergillus niger 在果汁饮料中的微 量存在，及时发现果汁饮料中有害菌，实现有效的监测及预防作用；
[0029] 其三，本发明相对于目前其他以PCR技术为基础的分子生物学检测手段，能够在 一次反应中集成检测4种果汁饮料污染菌，节约了检测成本，节省了检测时间，检测时间由 原7~14天缩短到8h。
【附图说明】
[0030] 图1为本发明具体实施例1的多重PCR-毛细管电泳谱图；
[0031] 图2为本发明具体实施例2的多重PCR-毛细管电泳谱图。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的分析。
[0033] 实施例1 :
[0034] (1)果汁饮料污染菌的培养及DNA模板提取：
[0035] 挑取平板培养基上长出的桔青霉Penicillium citrinum、酿酒酵母 Saccharomyces cereviseae、酉孝母菌 Dekera naardenensis、黑曲霉 Aspergillus niger 单 菌落加入10mL成品苹果汁中，混匀，制成菌悬液；取lmL该菌悬液加入1. 5ml离心管中， 13, OOOXg离心2min，收集细胞沉淀，移去上清液；加入480ul的50mMEDTA彻底重悬细胞； 加入120ul的10mg/ml溶酶菌，37°C孵育60min，13, 000Xg离心2min，移去上清液。之后按 照Qiagen公司的Genomic DNA Purification Kit试剂盒的使用说明提取果汁饮料污染菌 的DNA模板，并使用紫外分光光度计在260nm波长条件下测定提取的DNA质量，将DNA溶液 稀释至250ng/ul，-20°C保存备用。
[0036] (2)四重PCR扩增
[0037] 所用引物体系为表1所述的SEQ ID NO. l-8,20ulPCR反应体系：100nM正向8， 20ulPCR反应体系：100nM正向混合引物2ul，100nM反向混合引物2ul，25mM的MgC124ul， 5 X PCRBuf f er4ul，5U/ul的Taq聚合酶0. 7ul，DNA模板lul，补足双蒸水使总体积为20ul ; 95°C预变性lOmin ;以94°C 30s ;58°C 30s ;70°C lmin为1个循环，共进行35个循环；4°C保 温；（3)毛细管电泳分离条件
[0038] 分离体系：lul所述步骤（2)中所得的扩增产物与95%去离子甲酰胺38. 5ul， 400bpDNA MarkerO. 5ul混合均勾；分离条件：在50°C、6. OKV电压下，分离35min ;
[0039] 使用贝克曼库尔使用贝克曼库尔特的GenomeLabGeXP Genetic Analysis System 分析系统自动对分离结果进行分析，结果图1所示，在基因片段长度为160bp、192bp、 201bp、247bp相应位置处均出现特征峰，故四种污染菌基因被检出，认为检测过程果汁对检 测结果没有影响，使用本发明能够捕捉到样品中桔青霉Penicillium citrinum、酿酒酵母 Saccharomyces cereviseae、酉孝母菌 Dekera naardene