[0092] siRNA2-ZNRDl ：
[0093] 正义链为 5' -AUCUAAAAACCCAGUAUCCUU-3'（SEQ ID NO. 5);
[0094] 反义链为 5' -GGAUACUGGGUUUUUAGAUGC-3'（SEQ ID NO. 6)，
[0095] siRNA3-ZNRDl ：
[0096] 正义链为 5' -UAAGGAAAUUCAACUAAGGGU-3'（SEQ ID NO. 7);
[0097] 反义链为 5' -CCUUAGUUGAAUUUCCUUAUU-3'（SEQ ID NO. 8)
[0098] 阴性对照 siRNA 序列（siRNA-NC):
[0099] 正义链为 5' -CGUACGCGGAAUACUUCGA-3'（SEQ ID NO. 9);
[0100] 反义链为 5' -UCGAAGUAUUCCGCGUACG-3'（SEQ ID NO. 10)。
[0101] 2、细胞培养
[0102] 取血管平滑肌细胞HA-VSMC，用浓度10%小牛血清的高糖1640培养基于37°C、浓 度5% C02的细胞培养箱中培养，每2d换液1次，取3-8代细胞进行试验。
[0103] 3、细胞转染
[0104] 将血管平滑肌细胞按1. 5X 104/孔接种到24孔细胞培养板中，在37°C、5% 0)2培 养箱中细胞培养24h，在无双抗、含10% FBS的高糖1640培养基中，转染按照脂质体转染试 剂2000 (购自于Invitrogen公司）的说明书转染，实验分为、阴性对照组和实验组（20nM)， 其中，阴性对照组siRNA与ZNRD1基因的序列无同源性，浓度为20nM/孔，同时分别转染。
[0105] 4、利用QPCR实验检测siRNA的干扰效率
[0106] 4. 1提取细胞总RNA
[0107] 利用QIAGEN公司的组织/细胞RNA提取试剂盒提取细胞总RNA。
[0108] 4.2逆转录和0卩〇?
[0109] 逆转录：用逆转录缓冲液对1 μ g总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25 μ 1反应体 系，每个样品取1 μ g总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5Χ逆 转录缓冲液，10mm〇l/L dNTP，0.1mmol/l DTT，30ymmol/l Oligo dT，200U/yl M-MLV，模板 RNA。42°C孵育 lh，72°C 10min，短暂离心。
[0110] QPCR扩增：采用25 μ 1反应体系，每个样本设置3个平行管。配制以 下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系12. 5 μ 1，正向引物（5 μ Μ) 1 μ 1， 反向引物（5 μ Μ) 1 μ 1，模板cDNA 2. 0 μ 1，无酶水8. 5 μ 1 ;扩增ZNRD1基因的 正向引物序列为 5' -CATGAAGGAATGGCATAC-3'（SEQ ID NO. 11)，反向引物序 列为 5' -TTGGTACAGGTGTAGAAG-3'（SEQ ID NO. 12);扩增 GAPDH 基因的正向 引物序列为 5'-AAAGGGTCATCATCTCTG-3'（SEQ ID NO. 13)，反向引物序列为 5'-GCTGTTGTCATACTTCTC-3'（SEQ ID NO. 14)，各项操作均于冰上进行。扩增程序为： 95°C5min，（95°C10s，60°C60s)*45 个循环。以 SYBR Green 作为荧光标记物，在 Light Cycler焚光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带， Δ ACT法进行相对定量。
[0111] 4. 3统计学方法
[0112] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值土标准差的方式来表 示，采用SPSS13. 0统计软件来进行统计分析的，干扰ZNRD1基因表达组与对照组之间的差 异采用t检验，认为当P〈0. 05时具有统计学意义。
[0113] 4. 4 结果
[0114] 结果如图 3 显示，与 siRNAl-ZNRDl、siRNA3-ZNRDl 相比，siRNA2-ZNRDl 能够更有 效的抑制ZNRD1基因的表达，差异具有统计学意义（P〈0. 05)，使用siRNA2-ZNRDl进行后续 的实验。
[0115] 5、利用Western blot实验检测siRNA2-ZNRDl的干扰效率
[0116] 细胞培养、转染步骤同前面所述；蛋白提取、数据处理同实施例1。
[0117] 结果：
[0118] 结果如图4显示，与对照组相比，siRNA2-ZNRDl能明显降低ZNRD1蛋白的表达水 平，差异具有统计学意义（P〈〇. 05)。
[0119] 实施例3 ZNRD1基因对血管平滑肌细胞凋亡的影响
[0120] 使用Annexin V-FITC/PI双染法利用流式细胞仪检测细胞凋亡的情况，步骤如 下：
[0121] 1、细胞转染：按照实施例2的方法对血管平滑肌细胞进行siRNA2-ZNRDl和 siRNA-NC的转染。
[0122] 2、细胞转染48h后，收获细胞，按照Annexin V-FITC/PI双染试剂盒（购自 Invitrogen公司）的操作说明进行细胞处理。
[0123] 3、将经过步骤2处理的细胞通过流式细胞仪检测。
[0124] 4、统计学方法
[0125] 统计细胞存活率，细胞存活率=1-细胞凋亡率，实验都是按照重复3次来完成的， 结果数据都是以平均值土标准差的方式来表示，采用SPSS13. 0统计软件来进行统计分析 的，两者之间的差异采用t检验，认为当P〈0. 05时具有统计学意义。
[0126] 5、结果
[0127] 结果如图5所示，与转染siRNA-NC细胞组相比，转染siRNA2-ZNRDl的细胞存活率 降低，差异具有统计学意义（P〈〇. 05)。
[0128] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进 和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 检测ZNRD1基因表达的产品在制备诊断颅内动脉瘤的工具中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量 PCR、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测ZNRD1基因表达以诊断颅内动脉瘤的产品；所 述用RT-PCR诊断颅内动脉瘤的产品至少包括一对特异扩增ZNRD1基因的引物；所述用实时 定量PCR诊断颅内动脉瘤的产品至少包括一对特异扩增ZNRD1基因的引物；所述用免疫检 测诊断颅内动脉瘤的产品包括：与ZNRD1蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断颅 内动脉瘤的产品包括：与ZNRD1基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断颅内动脉瘤 的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与ZNRD1蛋白特异性结合的抗体， 基因芯片包括与ZNRD1基因的核酸序列杂交的探针。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断颅内动脉瘤的产 品至少包括的一对特异扩增ZNRD1基因的引物如SEQIDNO. 11和SEQIDNO. 12所示。4. 一种诊断颅内动脉瘤的工具，其特征在于，所述工具包括检测ZNRD1基因表达的试 剂。5. 根据权利要求4所述的工具，其特征在于，所述试剂包括检测ZNRD1基因mRNA的引 物和/或探针、和/或检测ZNRD1蛋白的抗体。6. 根据权利要求5所述的工具，其特征在于，所述检测ZNRD1基因mRNA的引物包括SEQ IDNO. 11和SEQIDNO. 12所示的引物对。 7. ZNRD1基因和/或其表达产物的促进剂在制备治疗颅内动脉瘤的药物中的应用。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述促进ZNRD1基因表达的试剂、促进 ZNRD1基因表达产物稳定性的试剂、促进ZNRD1基因表达产物活性的试剂、促进ZNRD1基因 表达产物功能的试剂。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，促进ZNRD1基因表达的试剂包括含有 ZNRD1基因的试剂、携带ZNRD1基因的载体或宿主细胞所形成的试剂、含有ZNRD1蛋白质的 试剂。10. -种用于治疗颅内动脉瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括7-9中 任一项所述的促进剂。
【专利摘要】本发明公开了ZNRD1基因及其表达产物可以作为颅内动脉瘤诊治的分子标志物。通过检测受试者动脉组织中ZNRD1基因及其表达产物的含量可以判断受试者是否患有颅内动脉瘤或者诊断受试者是否存在患有颅内动脉瘤的风险。本发明通过研究体外培养的血管平滑肌细胞的凋亡情况发现干扰ZNRD1基因表达可以促进血管平滑肌细胞凋亡，上述研究结果表明ZNRD1基因及其表达产物是治疗颅内动脉瘤的一个潜在的药物靶点。
【IPC分类】C12Q1/68, A61K45/00, A61P9/00, G01N33/68
【公开号】CN105316417
【申请号】CN201510849589
【发明人】杨承刚, 李曙光
【申请人】北京泱深生物信息技术有限公司
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年11月27日