N0:3 的氨基酸 19-201
[0116] (成熟蛋白）
[0117] 现在，将对照附图，在下述实例中描述本发明，其中：
[0118] 图1表明了用ELISA检测Ad. SDC2表达MSC的上清液中脱落SDC2的情况；
[0119] 图2表明Ad. SDC2过度表达导致SDC2蛋白过度表达，所述过度表达在72小时期 间增加；
[0120] 图3表明，与亲代MSC相比，Ad.SDC2MSC( "S2"）的免疫抑制活性明显提高；
[0121] 图4表明了含SDC2的细胞培养上清液（"S2"）对T细胞增殖的影响的分析；
[0122] 图5表明了 SDC2蛋白抑制了 TNF α和IL1 β对NFkB的活化；
[0123] 图6表明了响应重组SDC2及TNF α和IL1 β引起的活化得到的NFkB诱导；
[0124] 图7表明了响应TNF α和IL1 β活化后SDC2过度表达的NFkB诱导；
[0125] 图8表明了 MSC的nutlin-3a处理导致SDC2脱落剂量依赖性增加。
[0126] 图9表明了化疗增强了 SDC2从人MSC上的脱落；
[0127] 图10表明SDC-2C-末端删除片段（1-6)的过度表达降低了 NF_kB响应IL-1 β和 TNF-α的活性；及
[0128] 图11表明了 SDC-2的腺病毒表达降低了响应IL-1 β、TNF a和IL-1 β /TNF a的 NF-kB活性和IL6/IL8分泌。
[0129] 实例1 - SDC2表汰增强提供免痔抑制件
[0130] 方法
[0131] MSC的转导
[0132] 将MSC按每孔105个细胞的密度平板接种于6-孔板（Nunc)完全培养基（a -MEM， 10% FBS)内，让其粘附过夜。细胞不进行转导作为阴性对照，或采用1 μ 1腺病毒（
[0133] 蛋白质印迹分析
[0134] 通过胰蛋白酶消化收获细胞，并在含50禮1^8?!17.4、10%甘油、0.5%即40、 150mM NaCl和完全迷你型蛋白酶（抑制剂（Roche)的细胞裂解缓冲液中裂解。让细胞裂 解液进行10% SDS-PAGE ;每个轨道加载50 μ g蛋白质。将抗人多配体蛋白聚糖-2Ab(R&D systems)按1:500稀释在TBS 0.1% Tween，3% BSA溶液中，进行蛋白质检测。将与辣根 过氧化物酶结合的二级抗大鼠 IgG抗体（Santa Cruz)按1:1000稀释度加入。然后，利用 ECL蛋白质印迹化学发光试剂（Pierce)和Flourochem成像系统，进行检测。
[0135] 酶联免疫吸附试验
[0136] 利用酶联免疫吸附试验测定收集的上清液中人多配体蛋白聚糖_2的水平。采用 商业上可获取的ELISA试验来测定SDC2的水平（⑶SABI0)。按照生产商的说明开展试验。 利用纯化的SDC2标准品的制作校正曲线。按照生产商的说明，通过S形（sigmoidal)逻辑 回归法完成曲线拟合。
[0137] 人外周血单核细胞的分离
[0138] 为了分离外周血单核细胞（PBMC)，收集抗凝血样（7_8ml)，分层放到液体密度梯 度培养基（GE Healthcare)上，在室温以400xg离心分离30分钟。吸出顶层并舍弃，小心 移取对应的密度中间层（沉棕黄层），转移到新的50ml管内，收获PBMC。加入20ml PBS洗 涤PBMC 2次，以400xg离心分离10分钟。然后，以200xg低速离心分离10分钟，以脱除血 小板。将PBMC在T细胞培养基（RPMI-1640, Gibco)中重悬，该T细胞培养基在洛斯维?帕 克纪念研究所（RPMI)培养基中含10% FBS、5OyM0巯基乙醇、1% NEAA、1% L-谷氨酰胺。 取出10 μ 1等份的这种悬浮液，并采用血球计测定细胞数。
[0139] 人Τ细胞增殖试验
[0140] 采用0· 1 % BSA/PBS洗涤人PBMC，并按浓度2χ107个细胞/ml在预热（37°C )的 ΙΟμΜ Vybrant羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯（CFSE)/PBS染色溶液（Invitrogen)中 染色。将细胞在37°C、避光的条件下培养6分钟，加入5体积冰冷的含10% FBS的培养基， 使反应停止。用培养基洗涤PBMC 3次，以脱除未结合的CFSE的所有痕迹。将10万个CFSE 染色的PBMC在96-孔圆底板中用T细胞培养基中的抗人CD3/抗人CD28可溶性多克隆抗 体进行刺激。然后，向经过刺激的PBMC中按各种比例（1:10、1:50、1:100、1:200和1:400) 加入MSC。亦培养不进行刺激的PBMC作为对照。4天后，收获PBMC，之后移除上清液，将细 胞在100 μ 1含2% FBS的autoMACS清洗液中进行洗涤。然后，采用抗-人⑶4+-APC进行 复染色。利用FACSCanto分析PBMC的CFSE荧光。分析所有增殖，并与没有MSC共培养的 刺激的PBMC进行对比。
[0141] 结果
[0142] 采用SDC2 ELISA可检测出Ad. SDC2讨度表汰MSC h清液中的脱落SDC2
[0143] 采用Ad. EGFP或Ad. SDC2转导24小时后，吸出培养基，并代之以无血清培养基，并 在24、48和72h后收集。此上清液用于SDC2ELISA，包括新鲜无血清培养基作为对照。
[0144] 多配体蛋白聚糖在称为脱落的过程中，通常在质膜附近发生调节裂解。多配体蛋 白聚糖胞外域的释放不仅会下调信号转导，而且将膜结合受体转化为可溶效应子/或拮抗 剂（Manon-Jensen etal.，2010)〇
[0145] 通过采用人特异性SDC2ELISA技术，我们能够对huMSC脱落的SDC2蛋白进行检 测和定量。我们测定Ad. EGFP和Ad. SDC2表达MSC培养基中脱落的SDC2蛋白的水平。在 48小时后检测Ad. EGFP细胞培养基中的SDC2 (346. 4pg/ml)，72小时后，这一数值增加到 689. 2pg/ml。48小时时，SDC2过表达细胞显示培养基中脱落SDC2的水平增加（456pg/ml)， 在72小时时，其水平大约是Ad. EGFP的2倍（1412. 7pg/ml)(参见图1)。
[0146] 参考图1，转导后24小时，将完全培养基换为无血清培养基（1ml/孔）。48小时 和72小时后收集无血清上清液。采用商业上可获取的SDC2ELISA试剂盒来检测上清液中 存在的脱落SDC2。与Ad. EGFP表达细胞相比，Ad. SDC2上清液中的脱落SDC2的量增加（~ 2倍）。
[0147] 接下来，检测SDC2的蛋白表达，以确保无血清培养基不会影响过度表达。
[0148] Ad. SDC2讨度表汰导致高水平的SDC2蛋白表汰
[0149] HuMSC按1 X 105个细胞/孔的密度接种在6孔板上&让其粘附24小时。然后，采 用Ad. EGFP或Ad. S2 (1 X 1012vp/ml)转导HuMSC。转导24小时后，将完全培养基换为无血 清培养基。24、48和72小时后收获蛋白裂解液。对这些裂解液进行SDC2蛋白质印迹分析 (R&D)，结果发现，SDC2蛋白表达显著增加。我们观察到，与核心蛋白（~25kDa)及其二聚 形式（~48kDa)的分子量对应的SDC2条带增加（参见图2)。
[0150] 免痔抑制潜力随SDC2讨度表汰增加而增加
[0151] 已经证明，在Ad. SDC2转导后，SDC2蛋白表达增加，此外，从细胞表面脱落的可溶 形式的SDC2也增加。我们对SDC2过度表达对huMSC免疫抑制潜力的影响（如果有任何影 响的话）进行了研究。
[0152] 利用T细胞增殖试验，对亲代细胞、Ad. EGFP细胞和Ad. SDC2hMSC细胞的免疫抑制 潜力进行了评价。利用CFSE表达的流式细胞分析，测定了 PBMC的T细胞（CD4+)部分的增 殖。CFSE是一种用于评价细胞增殖的荧光细胞染料，每次细胞分裂之后，其荧光随子细胞逐 渐减半。由于存在MSC，受刺激T细胞的免疫抑制导致增殖抑制。在Ad. SDC2过度表达MSC 的存在下，增殖明显降低。结果以3代百分比增殖显示。在1:200MSC:PBMC比率时，与经 刺激的T细胞阳性对照相比，Ad. SDC2MSC表现出显著的T细胞免疫抑制潜力（使用1:10、 1:50和1:100比率时，得到类似的结果）。与亲代MSC相比，Ad. EGFP细胞显示出可以比得 上的T细胞免疫抑制水平（参见图3)。
[0153] 参考图3,采用刺激T细胞共培养，对亲代细胞、Ad. EGFP细胞和Ad. SDC2细胞的免 疫抑制潜力进行评价，并采用流式细胞术进行定量。结果表明，Ad. SDC2细胞显著提高了免 疫抑制性，与刺激T细胞阳性对照相比，能够抑制T细胞增殖。Ad. EGFP群保持了与亲代MSC 相当的免疫抑制潜力，但是，与亲代及与Ad. EGFP MSC相比，Ad. SDC2群（标记为"S2"）显 示出明显增强的免疫抑制潜力（采用未配对T检验确定，=P < 0. 05, P < 0. 001)。
[0154] 因此，与亲代huMSC相比，huMSC中SDC2过度表达导致免疫抑制效果得到增强。
[0155] 实例2 -过度表达SDC2的细胞（MSC) h清液抑制T细朐增葙
[0156] 我们对过度表达SDC2的一群MSC的上清液的免疫抑制活性进行了试验。
[0157] 参考图4,结果表明，与来自两个对照：（1)亲代MSC( "亲代")，及（2)⑶3/⑶28刺 激的T细胞（"T细胞St"）的培养基相比，来自本发明细胞，即S2-过度表达的MSC("S2"） 的培养基，足以抑制CD3/CD28诱导的T细胞增殖。因此，该上清液具有免疫抑制性。
[0158] 实例 3
[0159] 作为治疗产品效力试验的SDC2试验方案
[0160] 我们开发了基于SDC2试验的产品效力测试方案。
[0161] 该方案包括：
[0162] 1.检测潜在产品中的SDC2水平
[0163] 2.与合格治疗产品最低预定水平进行对比
[0164] a.等于或高于最低预定水平=合格（测试结束）
[0165] b.低于最低预定水平=不合格
[0166] 3.与不合格治疗产品的最高水平进行对比
[0167] a.低于最高水平=舍弃（测试结束）
[0168] b.处于合格治疗产品的最低预定水平和不合格治疗产品的最高水平之间=进行 处理，以提高SDC2水平，然后重复试验
[0169] 实例 4
[0170] 作为治疗产品效力试验的SDC2试验
[0171] 我们将实例3的方案在人细胞制备物的一特定试验中实施。
[0172] 该方案采用下述预定水平：
[0173] 1.我们对潜在产品中的SDC2水平进行了试验
[0174] 2. SDC2水平等于或高于1400pg/ml的制备物被认为适合进行进一步处理作为潜 在治疗产品；制备物低于该水平被认为不合格
[0175] 3. SDC2水平低于500pg/ml的制备物一开始被标注为不适合进一步处理
[0176] 4. 500至1400pg/ml之间的制备物被鉴定为适合采用SDC2活化剂进行处理，以提 高其SDC2水平
[0177] 5.然后，我们还注意到，即使SDC2水平低于500pg/ml的制备物也可以采用SDC2 活化剂进行处理，以提高其SDC2水平
[0178] 6. SDC2水平升高到1400pg/ml以上的经处理细胞被认为适合进行进一步处理作 为潜在治疗产品。
[0179] 实例5-活化d53以增加内源SDC2
[0180] 我们对各种HDAC抑制剂对一开始根据SDC2表达分离，然后在培养中保持的人细 胞群上SDC2表达的影响进行了测试。
[0181] 在24小时时，斯普利特麻一辛（Splitomicin)、丙戊酸和2-吡咯烷酮-正-丁酸 (PBA)的SDC2RNA水平均增加，其中斯普利特麻一辛的刺激最大。
[0182] 类似地，我们对环境毒素苯并[a]芘-7, 8-二醇-9, 10-环氧化物（BTOE)进行了 测试，发现600nM BPDE使SDC2分泌增加了近3倍。
[0183] 实例6 -供体细朐群的SDC2水平
[0184] 对3个人MSC供体（供体细胞制备物）的SDC2分泌水平进行了测试。结果表明， 其中两个供体被鉴定为良好执行者（标记为供体109和110)，具有高水平的SDC2,而第三 个供体被鉴定为差执行者（供体111)，具有低水平的SDC2,并且未能通过实例4的SDC2试 验。
[0185] 实例 7
[0186] 局部施用SDC2+、SDC2-和PA-SSC在糖尿病伤口愈合方而的对比
[0187] 我们利用ExcdlageiA ( -种纤维状牛I型胶原高纯度配制匀浆）对各种干细胞 群在伤口愈合模型方面的活性进行了对比。
[0188] 体内实验模型
[0189] 采用雄性新西兰白兔（3-3. 5kg)开展研究。通过耳缘静脉给予Alloxan (150mg/ kg)，在这些兔子中诱发糖尿病。利用Accuch