（刘少华，2005)提取分离物的 培养7天后的菌丝总DNA，运用稻瘟菌特异性引物（见序列表SEQIDNO:2-3所示）进行 PCR扩增。菌株均能扩增得到一条长度约为702bp的特异性条带，进一步对PCR产物进行测 序，经NCBI网站blast比对，发现所有比对结果均为稻瘟菌。
[0028] 本实施例所用的特异引物Phf2a/Phf2b由武汉擎科创新生物科技有限公司合成。
[0029] 1)特异性引物的核苷酸序列如下所示：
[0030]Phf2a:cgtcacacgttcttcaacc(见序列表SEQIDN0:2所不）：
[0031]Phf2b:cgtttcacgcttctccg(见序列表SEQIDN0 :3 所不），
[0032] 2)扩增的特异性条带的核苷酸序列如下（SEQIDN0 :1所示）：
[0033]
[0035] 上述扩增的特异性条带（序列长度为702bp)由武汉擎科创新生物科技有限公司 完成测序。
[0036] 稻瘟病菌GFP荧光菌株Y4的保存
[0037] 打取菌株Y4直径为6mm菌丝块，置于铺有灭菌滤纸片（1cmX1cm)的PDA平板上， 于28°C，光照条件下培养，待7天后菌丝长满滤纸片，再将滤纸片揭下，放入硫酸纸袋中并 封口，置于28°C烘箱中干燥20天，然后放置于-20Γ条件下作为长期保存的菌株，需要时进 行按常规方法活化。
[0038] 实施例2:
[0039] 稻瘟病菌荧光转化子的生物学表型分析
[0040] 打取直径为6mm(菌株Y4)菌丝块，置于PDA平板上，3个重复，28°C恒温光照培养 箱中培养，自接种之日起，隔天以十字交叉法测量菌落直径，7d后菌落照相。结果如表1所 示。观察其菌落形态，其菌落从中间到边缘依次是褐色、淡褐色、黑褐色、白色，气生菌丝不 发达，菌落形态呈典型稻瘟病菌菌落特征。
[0041] 将Y4直径为6mm的菌丝块接种于0ΜΑ培养基上，3个重复，光照黑暗交替28°C恒 温培养箱中培养7d，刮掉全部气生菌丝，再诱导产孢，48h后用ddH20洗涤菌丝并过滤收集 分生孢子，光学和荧光显微镜下观测分生孢子形态，分生孢子发绿色荧光，洋梨形或倒棍棒 形，顶端钝尖，基部钝圆，有脚胞，呈典型稻瘟病菌分生孢子特征。以血球计数板统计分生孢 子浓度。结果如表2所示，菌株Y4产孢量每平方厘米的产孢量可达到9. 43X105个/ml。
[0042] 将Y4直径为6mm的菌丝块接种于0ΜΑ培养基上，3个重复，光照黑暗交替28°C恒温 培养箱中培养5d，刮掉全部气生菌丝，再诱导产孢，48h后用ddH20洗涤菌丝并过滤收集分 生孢子，将获得的孢子液点接在疏水塑料玻片上，黑暗保湿12h后，用镊子把玻片反盖在载 玻片上，在光学显微镜下观察，孢子顶端萌发产生菌丝，菌丝末端膨大，产生近圆形附着胞， 并统计孢子萌发率。结果如表3所示。
[0043] 根据生物学表型分析，转化子Y4的生物学特性在菌落形态、生长，产孢，孢子萌发 等方面均具有较好的稳定性，因此选用该菌株作为稻瘟病菌根部接种菌株。
[0044] 表1稻瘟病菌Y4菌落生长速率测定
[0045]
[0046]
[0047] 实施例3 :
[0048] -种适用于根部接种的稻瘟病菌菌株Y4的应用：
[0049] 采用水稻根部贴接菌块的方法进行接种（图3)。水稻种子先在0. 1 %的高锰酸 钾中浸泡ld，然后换成清水浸泡两天，待水稻种子漏出白芽后，置于0. 7 %的水琼脂培养 基（水琼脂培养基成分：按g/L计，琼脂粉7g;补充蒸馏水至1000ml)上，黑暗条件、28°C 保湿催芽生长，直至幼根生长至5cm左右，将幼根生长健壮的幼苗移至装有35ml蛭石的玻 璃管中，将PDA上培养7d的直径为6mm的菌丝块贴接在幼根上，每个根上放4个菌块，其 上再加15ml的蛭石，根据设置水势的不同（分别设置五个不同的水势培养条件，培养条件 一 ：-2Kp，加 11. 26ml水；培养条件二：-10Kp，加 6. 91ml水；培养条件三：-20Kp，加 5. 30ml 水；培养条件四：_3〇Κρ，加4. 56ml水；培养条件五：-40Kp，加4. 12ml水。），加不同量的水。 用保鲜膜封口后分别置于5个不同温度条件下培养，即24、26、28、32和36°C。接种后，在 第7天、第9天、第11天、第13天统计叶部发病率（％)(表4)，在第13天洗根，统计根部 发病率（％ )(表5)。
[0050] 结果表明，接种后不同温度培养条件对稻瘟病根部发病的影响存在显著差异。在5 个水势处理中，-2Kp条件下，各温度环境下的植株发病率均为最高（图4)。培养条件一（即 温度24°C)，地上发病率和根部发病率分别为35%和46%;培养条件二（即温度26°C)，地 上发病率和根部发病率分别为37%和53% ;培养条件三（即温度28°C)，地上发病率和根 部发病率分别为43%和52% ;培养条件四（即温度32°C)，地上发病率和根部发病率分别 可达到60%和68% ;培养条件五（即温度36°C)，地上发病率和根部发病率分别为21 %和 25%〇
[0051] 在5个温度处理中，32°C环境下，各水势的植株发病率都是最高的。培养条件一 (即水势-2Kp)，地上发病率和根部发病率分别可达到60 %和68 % ;培养条件二（即水 势-ΙΟΚρ)，地上发病率和根部发病率分别为33%和50% ;培养条件三（即水势-20Κρ)，地 上发病率和根部发病率分别为28%和50% ;培养条件四（即水势-30Κρ)，地上发病率和根 部发病率分别为23%和40% ;培养条件五（即水势_40Κρ)，地上发病率和根部发病率分别 为 23%和 35%。
[0052] 因此，根部接种后将水稻放置在土壤水势为-2Κρ、温度为32°C的环境中，可获得 较好的发病效果。
[0053] 表4根部接种后不同温度和土壤湿度对水稻根部发病的影响
[0054]
[0055] 表5根部接种后不同温度和土壤湿度对水稻地上部发病的影响
[0056]
【主权项】
1. 稻瘟病菌菌株Y4,其特征在于：稻瘟菌（#a抑即orMeoiyzae)Y4,保藏编号：CCTCC NO：M2015592〇2. 权利要求1所述的菌株在侵染水稻中的应用。3. 根据权利要求2所述的应用，所述的菌株用于侵染水稻根部。4. 根据权利要求3所述的应用，其应用过程包括：采用菌丝块根部接种法，水稻种子置 于0. 7%的水琼脂培养基上，黑暗28°C保湿催芽生长，直至幼根生长至5-6cm，将幼根生长健 壮的幼苗移至装有35ml蛭石的玻璃管中，4个菌块放在幼根上，其上用15ml的蛭石覆盖，再 加水至蛭石水势为-2Kp，接种后的水稻植株放置在32°C、16h光照/8h黑暗条件的培养箱中 生长； 所述的菌块为保藏号为CCTCCNO:M2015592的稻痕病菌ar7zae)Y4的 菌块。
【专利摘要】本发明公开了一种适用于根部接种的稻瘟病菌菌株Y4及应用，本发明提供了一种适用于根部接种的稻瘟病菌菌株Y4；该菌株已于2015年10月8日送至中国典型培养物保藏中心保藏，稻瘟菌（<i>Magnaporthe</i><i>？oryzae</i>）Y4，保藏编号：CCTCC？NO：M2015592。同时围绕这个菌株研究并建立了一套高效稳定的稻瘟菌根部接种方法，使得水稻根部的发病率达到了68%，为进一步研究稻瘟菌根部侵染机制提供条件，在理论上可在病害循环、发病因素方面深入认识稻瘟病，在实践应用上，可为稻瘟病防控措施的正确实施提供指导。CCTCC NO：M201559220151008
【IPC分类】A01G7/06, C12R1/645, C12N1/14
【公开号】CN105349429
【申请号】CN201510680887
【发明人】郑露, 袁蕾, 汤近天, 黄俊斌
【申请人】华中农业大学
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年10月19日