到的来自水的峰的拉曼强 度与来自透明质酸的峰的拉曼强度的比率计算出与透明质酸浓度相关的数值。第二阶段 是如下阶段：使用平衡溶胀倍率已知的样品，制作平衡溶胀倍率和与透明质酸浓度相关的 数值的标准曲线，基于交联透明质酸凝胶颗粒内特定的微小范围中的与透明质酸浓度相关 的数值，计算出平衡溶胀倍率。更具体而言，由光学显微镜图像指定交联透明质酸凝胶颗 粒中的0. 5~5μπι范围的测定部分，由得到的光谱图求出来自透明质酸的C-H键的波数 (2940cm 3相对于来自水的O-H键的波数（3420cm 3的拉曼强度比，可以通过下述式（1)而 计算。
[0044] 平衡溶胀倍率的计算值=[(Hi3hZUh)-标准曲线的截距]/标准曲线的斜率·（1)
[0045] (H。H:3420cm 1 的拉曼强度、H c H:2940cm 1 的拉曼强度）
[0046] 交联透明质酸凝胶颗粒整体的平衡溶胀倍率通过对水系溶剂中（缓冲液中）处于 平衡溶胀状态的凝胶颗粒进行过滤而取出时的凝胶颗粒的体积与对该凝胶颗粒进一步干 燥时的体积的倍率来表示。
[0047] 上述平衡溶胀倍率可以使用通过过滤去除水系溶剂（缓冲液）时的交联透明质酸 凝胶的湿润重量与进一步使之干燥时的交联透明质酸凝胶的重量比（Qw)和密度，通过下 述式⑵而算出。
[0048] 平衡溶胀倍率=1+ ( P / P 0) X (Qw-I) · (2)
[0049] ( P :交联透明质酸凝胶颗粒的密度、P 0 :水系溶剂（缓冲液）的密度）
[0050] 对于通过过滤去除水系溶剂（缓冲液）的方法没有特别的限定，可以适宜使用例 如使用了离心式过滤单元的离心过滤法、使用了膜滤器的减压过滤法等。
[0051] 平衡溶胀倍率受到溶剂的盐浓度、pH、温度、溶胀时间等影响，所以用NaCl浓度为 0. 9wt %的IOmM磷酸缓冲生理盐水（pH6. 0)，5°C下使之溶胀1天，到达平衡溶胀状态之后进 行测定。
[0052] 需要说明的是，根据核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的组成和平衡溶胀倍率的测定 法，拐点处的平衡溶胀倍率可以为20~80的范围（特别为40~60的范围，50左右）。
[0053] 对于核壳型交联透明质酸凝胶颗粒，从表面起至深度SOOnm的探针压入力为20nN 以下。此处，深度方向优选为从表面到中心（重心）的方向。另外，探针压入力是指作为使 用扫描型探针显微镜测定的弹性而测定的。即，将水系溶剂中（缓冲液中）处于平衡溶胀 状态的交联透明质酸凝胶颗粒置于试样台，由上方将前端安装有IOym直径的（球形）玻 璃颗粒的胶体探针从交联透明质酸凝胶表面压入至深度800nm，作为施加到探针的力（探 针压入力）而测定。
[0054] 压入力优选为IOnN以下。压入力为20nN以下是指核壳型交联透明质酸凝胶颗粒 表面的弹性低，即便在向生物体内给予的情况下，在生物体内也不易被识别为异物，所以炎 症作用被抑制，从而能够确保与透明质酸溶液同样高的生物体亲和性。
[0055] 从拐点至表面的点即壳的平衡溶胀倍率优选为40以上，更优选为50以上，进一步 优选为65以上。通过使核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的壳的平衡溶胀倍率为上述范围，能 够确保该颗粒的表面为接近透明质酸溶液的柔软度，所以能够得到在生物体内不易被识别 为异物、异物反应被降低至与透明质酸溶液相同程度的、具有高的生物体亲和性的颗粒。由 以上这样的观点可知，上述平衡溶胀倍率特别优选为75以上。需要说明的是，壳的平衡溶 胀倍率显示出高于上述拐点的平衡溶胀倍率的值。
[0056] 从拐点至前述表面的点的、核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的厚度方向的距离优选 为5 μπι以上。该距离为针对核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的至少1处以上从中心到表面 依次测定特定微小范围中的平衡溶胀倍率时的、从前述拐点至前述表面的点的移动距离即 可。通过壳的厚度为上述范围，核壳型交联透明质酸凝胶颗粒在生物体内不易被识别为异 物，能够确保与透明质酸溶液同样高的生物体亲和性。另外，给予该凝胶颗粒之后，在关节 内等平衡溶胀倍率高的壳表面部分即便分解，也会从内部新生成平衡溶胀倍率高的壳表面 部分，所以能够长期地维持与透明质酸溶液同样高的生物体亲和性。由以上的观点可知，上 述壳的厚度优选为10 μπι以上。
[0057] 对于核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的壳的厚度，也可以通过仅对核进行了染色的 核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的显微镜观察、作为外壳的透明部分的厚度方向的长度进行 测定。具体而言，用数字显微镜对被染色的核壳型交联透明质酸凝胶的图像进行拍摄，对每 1个凝胶颗粒测定1点以上从该凝胶颗粒表面至核与壳的边界的距离。对于凝胶颗粒100 个进行该测定，可以由其平均值算出壳的厚度。
[0058] 染色也可以通过能够对透明质酸染色的公知的任意方法进行，但优选用亚甲基蓝 或吖啶橙进行染色。进而，由于容易判断透明的壳与水系溶剂的边界，所以更优选只将水系 溶剂用苯胺黑等进行负染色。具体而言，对于水系溶剂中（缓冲液中）处于平衡溶胀状态 的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒添加亚甲基蓝水溶液，充分搅拌而进行染色。接着，将样品 搭载于试样台，在即将利用数字显微镜进行观察之前，添加苯胺黑水溶液，由此能够进行负 染色。
[0059] 接着，对于制造核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的方法进行说明。
[0060] 本发明的实施方式中，对于透明质酸，无论是从动物组织提取的还是用发酵法制 造的，可以不问其来源地使用。
[0061] 发酵法中使用的菌株优选为从自然界中分离得到的链球菌属等具有透明质酸生 产能力的微生物、或者日本特开昭63-123392号公报中记载的马链球菌（Streptococcus equi)FM-100(微工研菌寄第9027号）、日本特开平2-234689号公报中记载的马链球菌 FM-300 (微工研菌寄第2319号）这样的以高收率生产稳定的透明质酸的变异株。
[0062] 透明质酸可以以例如钠、钾或锂盐这样的本技术领域中允许的盐的形态使用。
[0063] 交联透明质酸凝胶颗粒可以使用透明质酸自交联的具有酯结构的自交联透明质 酸凝胶颗粒。
[0064] 自交联透明质酸凝胶颗粒可以如下得到：使透明质酸与透明质酸浓度为5质量％ 以上的水以及与透明质酸的羧基等摩尔以上的酸成分共存，在低温下保持该共存状态。
[0065] 对于与透明质酸共存的酸，没有特别的限定，可以使用公知的任意种酸，优选为比 透明质酸强的酸，更优选为无机酸。进一步优选盐酸、硝酸或硫酸，其中，特别优选处理性等 优异的硝酸。对于共存的酸的量，没有特别的限定，可以为与透明质酸的羧基等摩尔以上的 酸成分的量。对于与透明质酸共存的酸，优选以含有透明质酸为整体的15质量％以上、优 选20质量％以上且40质量％以下的量保持。该保持可以为-30°C以上且25°C以下的温度 下1小时~20天的任意期间。特别优选在-25°C以上且_5°C以下的温度下保持1天~15 天。透明质酸和与透明质酸共存的酸的混合优选如下进行：向共存的酸中以成为整体的15 质量％以上、优选20质量％以上的方式加入透明质酸，使共存的酸为均匀的状态。除此以 外，也可以以成为整体的15质量％以上、优选20质量％以上的方式浸渍与透明质酸共存的 酸，进而也可以对以低浓度调节的透明质酸的酸性水溶液进行浓缩以使透明质酸成为整体 的15质量％以上、优选20质量％以上。
[0066] 得到的自交联透明质酸凝胶颗粒在悬浮液中的浓度例如可以如下进行定量。首 先，用蒸馏水对自交联透明质酸凝胶悬浮液进行稀释，添加氢氧化钠水溶液，在室温下进行 静置，由此将自交联透明质酸凝胶颗粒的酯键水解，从而溶解。接着，向该溶液中添加盐酸 进行中和之后，通过本领域技术人员已知的咔唑硫酸法对葡萄糖醛酸浓度进行定量。由该 葡萄糖醛酸浓度并将已知浓度的透明质酸作为标准物质，从而能够计算出自交联透明质酸 凝胶颗粒在悬浮液中的浓度。
[0067] 作为核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的制造方法，可列举出：将交联透明质酸凝胶 颗粒的表面部分的交联结构部分溶解并软化从而壳化的表面处理法；或者，在该颗粒的表 面形成软的壳的壳合成法。通过这样的制造方法得到的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒由于 在生物体内不易被识别为异物，所以能够抑制炎症作用，并且能够确保与透明质酸溶液同 样高的生物体亲和性。
[0068] 上述表面处理法是使之软化而壳化的方法，即，通过能够特异地分解透明质酸的 交联结构的化学处理，将交联透明质酸凝胶颗粒的表面部分的交联部分地切断，降低透明 质酸的交联密度，由此增加平衡溶胀倍率。由此，能够使交联透明质酸凝胶颗粒形成核壳结 构。透明质酸的交联结构与能够特异地分解的化学处理的组合是任意的，可列举出例如：透 明质酸的自交联的酯结构与利用碱性物质的处理的组合。利用该组合的核壳型交联透明质 酸凝胶颗粒的制造方法是如下方法：以自交联透明质酸凝胶颗粒作为原料，用酸性溶液使 之溶胀之后，在水与水溶性有机溶剂的混合液中，使该凝胶颗粒的表面与碱性物质接触。碱 性物质由自交联透明质酸凝胶颗粒的表面向内部渗透，同时将酯键分解，从而增加经渗透 部分的平衡溶胀倍率。
[0069] 对于使自交联透明质酸凝胶颗粒溶胀的酸性溶液，没有特别的限定，可以使用公 知的任一种酸，优选