citance Tester (Linton Instrument公司制造、商品 名）的主体容器（保持器）中，进行静置5秒钟的操作。
[0153] 动物分别收容在安装在可动式齿条上的托架式金属制丝网地板笼 (350WX 500D X 350Hmm)中，在温度25 ± 3°C、湿度50 ± 20 %、换气次数12~18次/小时、照 明时间8 :00~20 :00(明12小时、暗12小时）的环境下进行饲养。对于试样，通过不锈钢 制喂食器，以150g/天的喂食限制给予实验动物用固体t耳料RC4(0riental Yeast Co.，ltd. 制），作为饮用水，通过聚丙烯制给水瓶（前管不锈钢制）自由地给予自来水。动物的个体 识别通过对耳廓用记号记录个体识别编号而进行识别，笼子中，在分组前附上记录了性别 和个体识别编号的卡片；在分组后附上记录了试验编号、给予组、性别、动物编号、手术日、 给予日、剖检日和个体识别编号的卡片。
[0154] 在半月板部分切除手术日的前一天进行分组。在分组日，对所有例的体重与两后 腿重量分配进行了测定。由测定的两后腿重量分配计算出左后腿重量分配比（（左荷重/ 两侧总计荷重）X 100 (%))。以左后腿重量分配比为基准，按照个体值接近平均值的顺序 进行选择。对于所选择的动物，使用基于左后腿的重量分配比的分层连续随机化法分配各 组。确认左后腿重量分配比的平均值在各组中显示相同的值且没有组间差异之后，对于体 重也确认了平均值在各组显示相同的值、没有组间差异。
[0155] 半月板部分切除手术在分组日的第二天进行，将半月板部分切除手术日定义为术 后〇天。使用14~15周龄的动物，参考参考文献1~3所述的方法，制作半月板部分切除 变形性关节病模型动物。
[0156] 例如，参考文献1中记载了 ：准备KBL :JW家兔（13周龄、雌）32只，在氯胺酮和甲 苯噻嗪麻醉下，将左侧膝关节的外侧侧副韧带和籽骨韧带切离，将半月板部分切除3. 0~ 4. 0_，使用26G的注射针对膝关节内以2周5次的频率，对A组和B组各8只注入高分子 量HA溶液，对于作为对照的C组8只注入生理盐水，对于C组和D组每天经口给予乐松 (Loxonin)，对于疼痛抑制效果和防止软骨变性效果进行评价。另外，参考文献2中记载了： 准备新西兰白色家兔（体重2~3kg) 72只，在麻醉下切断左侧膝关节的韧带，将半月板部 分切除3~4mm，对于膝关节内以每周2次的频率、期间在第2周和第4周，对A组的48只 注入分子量190万的1~0. 01% HA溶液，对B组的12只注入分子量80万的1~0. 01% HA溶液，对C组的12只注入生理盐水，处死之后，采集膝关节对药效进行评价。另外，参考 文献3中记载了：对日本白色家兔（雌、2. 5kg) 15只在戊巴比妥钠麻醉下，切断左侧膝关节 的外侧侧副韧带和籽骨韧带，将半月板部分切除3. 0~4. Omm，使用25G的注射针对膝关节 内以每周2次的频率进行注入，作为对照注入等量生理盐水，处死后，采集膝关节，对于药 效进行评价。
[0157] 参考文献 I :Osteoarthritis and Cartilage，Vol. 15, No. 5, P. 543-549 (2007)
[0158] 参考文献 2 :Osteoarthritis and Cartilage，Vol. 4, No. 2, ρ· 99-110 (1996)
[0159] 参考文献3 :关节外科、第15卷、第3号、p. 92-98 (1996)
[0160] 参考文献4 :药理与治疗、第23卷、P. 833-841 (1995)
[0161] 参考文献5 :药理与治疗、第33卷、p. 303-312(2005)
[0162] 参考文献6 :整形外科基础科学、第9卷、p. 77-79(1982)
[0163] 参考文献7 :整形外科基础科学、第11卷、p. 125-127(1984)
[0164] 参考文献 8 :Arthritis&Rheumatism，Vol. 48, No. 7, P. 1923-1929(2003)
[0165] 在大腿部肌肉内注射盐酸氯胺酮（Sankyo Yell Yakuhin Co.，Ltd.制；Ketalar 肌肉注射用500mg、产品名）和甲苯噻嗪（Intervet Κ·Κ·制；Skilpe 2%注射液、产品名） 进行组合麻醉下，对兔子的左膝关节部份进行除毛，背位固定于北岛式固定器（NATSUME SEISAKUSH0 CO LTD.制）。无菌地在膝盖的外侧正下面皮肤施加约2cm的切口，使外侧侧 副韧带显露之后，将该韧带切除。进一步，将膝盖窝肌肉起始部的腱切除，由此使外侧半月 板显露，将半月板的大致中央部切除3. 0-4. 0mm。之后，对于皮下肌肉层和皮肤分别进行 结节缝合，对大腿部肌肉内注射氨节西林（Meiji Seika Pharma Co. ,Ltd.制；Bikushirin sol-15%、产品名）约 0· 2mL〇
[0166] 在手术后4天（疼痛发病日）的两后腿重量分配测定之后，使用ImL注射筒和23G 注射针对手术侧（左侧）膝关节腔内给予1次实施例3~4和参考例1的注射剂0.1 mL/ kg。给予液量可以通过基于在给予日测定的体重的液量换算而分别地算出。
[0167] 两后腿重量分配的测定中使用小动物用镇痛评价装置Incapacitance Tester。本 装置通过设置于容器底面的双通道的传感器垫，将左右各自的重量以克为单位正确地检测 放入至主体容器的动物的左右腿的重量分配，将该值用试验者所设定的时间进行平均化。 主体容器使用兔子用的容器。测定设定时间设为在动物的静止状态下5秒。
[0168] 使动物在兔子用主体容器（保持器）内移动，在动物的静止状态下进行测定（第 1次），接着使动物从保持器中出来，再次放入并在静止状态下进行测定（第2次），再次重 复该操作（第3次）。分别对于3次测定的两后腿重量分配，由左右重量（荷重）通过下述 式⑷计算出左后腿重量分配比（％)。
[0169] 左后腿重量分配比（％ ) = {左荷重（gV(右荷重（g) +左荷重（g)) X100} · (4)
[0170] 将3次计算出的左后腿重量分配比（％)的平均值定义为每测定1次的左后腿重 量分配比（％)。将该结果示于图2和图3。
[0171] 如图2和图3所示，可知给予了实施例3~4的核壳型交联透明质酸凝胶的兔子 与给予了参考例1的透明质酸溶液的兔子相比，能够更长地保持疼痛抑制效果。
[0172] 产业h的可利用件
[0173] 通过本发明，能够提供异物反应被降低至与透明质酸溶液相同程度、生物体亲和 性高的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒。另外，还提供该凝胶颗粒的制造方法以及包含该凝 胶颗粒的医用材料。
【主权项】
1. 一种核壳型交联透明质酸凝胶颗粒，其表面的平衡溶胀倍率比中心高，并且从中心 到表面的平衡溶胀倍率的变化曲线存在拐点， 从表面起至深度800nm的探针压入力为20nN以下。2. 根据权利要求1所述的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒，其中，从所述拐点至所述表 面的平衡溶胀倍率为40以上。3. -种核壳型交联透明质酸凝胶颗粒，其表面的平衡溶胀倍率比中心高，并且从中心 到表面的平衡溶胀倍率的变化曲线存在拐点， 从拐点至表面的平衡溶胀倍率为65以上。4. 根据权利要求1~3中任一项所述的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒，其中，从所述拐 点至所述表面的距离为5μm以上。5. -种制造权利要求1~4中任一项所述的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的制造方 法，其包括：使交联透明质酸凝胶颗粒与碱性物质接触，从而使该凝胶颗粒形成核壳结构。6. -种制造权利要求1~5中任一项所述的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的制造方 法，其包括：在交联透明质酸凝胶颗粒的表面形成透明质酸的交联密度低于该交联透明质 酸凝胶颗粒的交联透明质酸凝胶的壳。7. -种医用材料，其包含权利要求1~4中任一项所述的核壳型交联透明质酸凝胶颗 粒。8. 根据权利要求7所述的医用材料，其是选自关节注入剂、药理活性物质的载体、创伤 敷剂、组织替代型生物体组织修复剂、防粘连剂、止血剂、人工细胞外基质和皮肤填充剂中 的任意者。9. 根据权利要求7或8所述的医用材料，其是关节注入剂。
【专利摘要】本发明的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的表面的平衡溶胀倍率比中心高，并且从中心到表面的平衡溶胀倍率的变化曲线存在拐点，从表面起至深度800nm的探针压入力为20nN以下。
【IPC分类】A61L27/00, A61K9/14, C08B37/08, A61L31/00, A61K31/728, A61K47/36, A61L15/16
【公开号】CN105377899
【申请号】CN201480039029
【发明人】大野昭男, 桥本正道, 根本叶玲, 原田贵文, 藤井健治
【申请人】电化株式会社
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2014年7月8日
【公告号】CA2917715A1, EP3020733A1, US20160143943, WO2015005345A1