>[0107] (参考例1)
[0108] 使用透明质酸关节制剂"SUVENYL"（中外制药株式会社制造；粘均分子量200万、 透明质酸浓度lw/v%、商品名）。
[0109] (试验例1)
[0110] 对于实施例1~6以及比较例2~3的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒表面的弹性， 由利用扫描型探针显微镜的表面的探针压入力分析。需要说明的是，测定条件如下。
[0111] 扫描型探针显微镜：SPM-9700型（株式会社岛津制作所制造，商品名）
[0112] 探针：安装有10 μ m直径的（球形）玻璃质颗粒的胶体型探针（CP-C0NT-BSG-B、 TOYO Corporation 制造）
[0113] 压入距离：800nm
[0114] 测定次数：3次
[0115] 测定温度：23±2°C
[0116] 将各交联透明质酸凝胶颗粒的生理盐水悬浮液采集至装置内的试样台，置于装置 的台子上。用光学显微镜一边观察交联透明质酸凝胶颗粒，一边将探针设在测定位置的上 方，使探针向正下方移动3000nm左右，得到力曲线（force curve)。由通过测定得到的力曲 线，使从颗粒表面起至压入距离SOOnm期间探针弯曲的距离乘以探针的弹簧常数，算出力 的大小，作为弹性。
[0117] (试验例2)
[0118] 对于实施例1~6以及比较例2~3的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的平衡溶胀 倍率，以透明质酸浓度作为指标使用显微共焦激光拉曼光谱仪，作为相当于交联透明质酸 凝胶颗粒的平衡溶胀倍率的计算值进行分析。
[0119] 将各交联透明质酸凝胶颗粒的生理盐水悬浮液采集至载玻片上，用盖玻片覆盖悬 浮液表面，作为测定用试样。将试样搭载于显微共焦激光拉曼光谱仪内的XYZ 3轴自动台 子上，使用光学显微镜，在交联透明质酸凝胶颗粒的外部附近设置观测起始点。面向颗粒的 重心，使用在水平方向或垂直方向直线地重复进行移动和测定的自动测定功能，依次取得 0. 5~5 μL?的微小范围的拉曼光谱。需要说明的是，测定条件如下。
[0120] 显微共焦激光拉曼光谱仪：Almega-XR(Thermo Fisher Scientific Κ. Κ.制造，商 品名）
[0121] 激光波长：532nm
[0122] 曝光时间：1.0秒
[0123] 曝光次数：8次
[0124] 测定波数：4232 ~116cm 1
[0125] 测定温度：25 ±2 °C
[0126] 由拉曼光谱使用以下所示的式（3)，计算出0. 5~5 μπι的微小范围的平衡溶胀倍 率。对平衡溶胀倍率的计算值依次作图，利用S型函数导出近似曲线，算出从该近似曲线中 的拐点的位置即核与壳的边界至表面（也可以判定为，通过上述拉曼光谱算出的平衡溶胀 倍率开始出现大的变化（噪音），平衡溶胀倍率的移动平均值成为一定的点。）的平均值， 作为壳的平衡溶胀倍率。
[0127] 平衡溶胀倍率的计算值=[(H。h/Hc η)-3· 1598]/0· 2947 · (3)
[0128] 〇1。":3420〇11 1 的拉曼强度、HCH:2940cm 1 的拉曼强度）
[0129] 需要说明的是，由平衡溶胀倍率的图利用S型函数导出近似曲线，将其作为平衡 溶胀倍率的变化曲线。将得到的变化曲线的曲线图示于图4。在该变化曲线中求出拐点。 另外，对于表面的位置，通过如上所述的手法进行判断。
[0130] 进而，在壳与外部的边界难以判断的情况下，从试样中去除生理盐水，取而代之， 用来自水的O-H键的波数（3420cm 1)不具有峰的非水溶性液体（例如，石蜡等烃化合物） 进行悬浮，由此使壳与外部的平衡溶胀倍率的计算值较大地变化，计算出平衡溶胀倍率。
[0131] (试验例3)
[0132] 相对于实施例1~6以及比较例2~3的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒和比较例 1的自交联透明质酸凝胶颗粒的生理盐水悬浮液500 μ L，添加亚甲基蓝1 %水溶液5 μ L。在 室温下静置15分钟以上之后，在载玻片上采集70 μ L，进而加入苯胺黑1 %水溶液1 μ L，使 用数字显微镜（VHX-500F;KEYENCE CORPORATION制造，商品名）对交联透明质酸凝胶颗粒 的显微镜图像进行拍摄。将得到的图像示于图1。
[0133] 从得到的显微镜图像中，将亚甲基蓝能否染色的边界作为核与壳的边界，将苯胺 黑能否染色的边界作为壳与生理盐水的边界，对于每1个颗粒测定一处壳的厚度。计算出 总计100个凝胶颗粒的壳的厚度的平均值，将该值作为壳的厚度。
[0134] 上述的方法中，将亚甲基蓝1%水溶液变更为吖啶橙盐酸盐1%水溶液，通过同样 的方法计算出壳的厚度。
[0135] (试验例4)
[0136] 对于实施例1~6以及比较例2~3的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒和比较例1 的自交联透明质酸凝胶颗粒，与试验例2同样地计算出平衡溶胀倍率，计算出从核与壳的 边界至壳表面与作为外部的生理盐水的边界为止的分析移动距离作为壳的厚度。
[0137] (试验例5)
[0138] 对于实施例1~6以及比较例2~3的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒、比较例1 的自交联透明质酸凝胶颗粒和参考例1的透明质酸溶液，为了评价组织亲和性，将在兔子 膝关节内由于各试样所引起的局部刺激性而增加的白血球数作为指标，从而进行分析。
[0139] 用于进行动物评价的包含注射剂用核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的组合物的调 节如下进行。
[0140] 对于实施例1~6和比较例2~3中得到的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的悬浮 液，如下进行调节以使交联透明质酸凝胶颗粒的干燥重量相对于总体积（浓度）成为3w/ v% 〇
[0141] 对于核壳型交联透明质酸凝胶颗粒浓度的定量，将样品50mg用蒸馏水I. 55ml进 行稀释，向其中添加 IN氢氧化钠溶液0. 2ml，在室温下静置30分钟，由此对核壳型交联透明 质酸凝胶颗粒的酯交联进行水解，将核壳型交联透明质酸凝胶颗粒溶解。进一步，添加 IN 盐酸0. 2ml，进行中和之后，通过咔唑硫酸法，将已知浓度的透明质酸（粘均分子量190万） 作为标准物质，计算出核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的浓度。基于该定量结果，以核壳型交 联透明质酸凝胶颗粒的浓度成为3w/v%的方式进行调节，得到核壳型交联透明质酸凝胶颗 粒的动物评价用的组合物。
[0142] 用于进行动物评价的包含注射剂用自交联透明质酸凝胶颗粒的组合物的调节如 下进行。
[0143] 将比较例1中得到的自交联透明质酸凝胶颗粒的悬浮液投入至5°C、pH7. 0的IOmM 磷酸缓冲生理盐水中，每隔一小时更换IOmM磷酸缓冲生理盐水，重复进行2次。以自交联 透明质酸凝胶颗粒的干燥重量相对于该交联透明质酸组合物的总体积（浓度）成为3w/v% 的方式，用与上述的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的浓度的定量同样的方法进行。
[0144] 设置1天以上的驯化期间之后，使用ImL注射筒（TERUMO C0RP0RATION制造； TERUMO注射器ImL结核菌素用）和20G或21G注射针（TERUMO CORPORATION制造 ；TERUMO 注射针20G或21G)向单侧的膝关节腔内给予实施例1~6和比较例2~3的注射剂0.1 mL/ kg，向相反侧的膝关节腔内给予比较例1或参考例1的注射剂0. lmL/kg。给予液量基于在 给予日测定的体重、通过液量换算分别地算出。
[0145] 为了进行膝关节液回收，给予1天之后，利用放血致死法处死兔子。之后，使用ImL 注射筒和18G注射针向膝关节腔内注入生理盐水。使膝关节充分活动之后，使用ImL注射 筒和18G注射针对膝关节液进行回收。将该操作重复4次，得到约2mL的膝关节液样品。
[0146] 将回收的膝关节液样品用生理盐水稀释至3倍，充分地振荡，使之均匀地混悬 之后采集l〇〇yL，添加染色液（（武藤化学株式会社；Labostain、商品名）2yL对白血 球进行染色。将染色的关节液15 μ L采集到Neubauer血球计算盘上，使用显微镜，测定 1X1X0.1 mm区域内的白血球数。将4分区的平均值作为各膝关节的白血球数，成为生物体 亲和性的指标的各注射剂的白血球数作为上述膝关节数3以上的平均白血球数而求出。
[0147] 如表1所示可知，实施例1~6的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒与比较例1的自 交联透明质酸凝胶颗粒和比较例2~3的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒相比，生物体亲和 性提高，与参考例1的透明质酸溶液是同样的。由此可知，凝胶颗粒中的壳的有无、壳的厚 度和柔软度对于生物体亲和性是重要的。
[0148] [表 1]
[0149]
[0150] (试验例6)
[0151] 对于实施例3~4的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒和参考例1的透明质酸溶液在 关节腔内注射对疼痛的作用，使用基于兔子的膝关节半月板部分切除的实验性变形性关节 病模型动物进行确认。
[0152] 作为动物，准备13周龄的Kbl =JW(SPF)系兔子（雄），作为对于评价装置的驯化， 放入小动物用镇痛评价装置Incapa