-25 ( δ Η2· 17)与 C-23(δ C32.8)， C-24(δ C155.8)， C-26(δ C21.6)， C-27(δ C21.6)和 C-28(δ C105.7)的 相关性表明了该化合物的侧链结构。两个低场碳信号[SC139.7(C-20)和121.4(C-22)] 和质子共振信号[S H5. 24 (m，H-22)]，表明C-20和C-22之间为双键。HMBC谱中 Η3-18 ( δ HO. 97)与 C-12 ( δ C39. 8)，C-13 ( δ C41. 9)，C-14 ( δ C56. 1)和 C-17 ( δ C57. 7)，以 及 Η3-19 ( δ HO. 85)与 C-I ( δ C37. 8)，C-5 ( δ C53. 4)，C-9 ( δ C46. 3)和 C-IO ( δ C35. 2)的相 关性表明该化合物为四环结构。此外，根据核磁数据可知C-3为酮羰基（δ C211. 7)。NOESY 谱中Η_12α与Η-17的相关性表明Η-17为α构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱， 以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过 E⑶试验确定，理论值与实验值基本一致（图2)。
[0026] 实施例2 :化合物（I )药理作用试验
[0027] -、材料和仪器
[0028] 人胰腺癌MiaPaCa-2细胞由天津医科大学附属肿瘤医院肿瘤研究所惠赠。化合物 (I )自制，HPLC归一化纯度大于98%。FBS、胰蛋白酶-EDTA消化液购于美国Hyclone公 司。PBS粉购于天津润泰科技发展有限公司。DMEM低糖培养液购于美国Gibco公司。MTT 购于美国Sigam公司。DMSO购于北京化工厂。注射用青霉素钠购于哈药集团制药总厂。注 射用硫酸链霉素购于大连美罗大药厂。
[0029] 超净工作台、细胞培养箱（美国Thermo公司），4°C冰箱、_20°C冰箱（山东青岛海 尔公司），-80°C冰箱（FormaScientific)，电热鼓风干燥箱（天津实验仪器厂），光学显微 镜（日本Olympus公司），倒置相差显微镜（德国Ieica公司），超速低温离心机（日本日 立公司），酶标仪（上海科华生物工程股份有限公司），E-Centrifug e(Wealtec)，微量加样 器（德国Eppendorf)，电子恒温水浴锅（余姚市东方电工仪器厂），高压灭菌锅（山东新华 医疗器械有限公司），电子天平（上海天平仪器厂）。
[0030] 二、试验方法
[0031] 1、细胞培养：
[0032] (1)常氧培养：将人胰腺癌MiaPaCa-2细胞放入5 % C02、37°C、饱和湿度的CO2孵 箱中贴壁培养，适时换培养液，细胞贴壁生长融合至80 %~90 %时传代。
[0033] (2)缺氧培养：将人胰腺癌MiaPaCa-2细胞放在5% C02、94% N2、l% 02、37°C、饱 和湿度的缺氧小室中培养。缺氧小室建立：缺氧装置为可调式培养容器，有一进气孔和一 出气孔。实验时，将缺氧培养的细胞放入可调式培养容器内，由进气孔充入低氧混合气体 (5% C02+95% N2+l% O2)，测得小室内氧气浓度维持在1%后密闭，移入细胞培养箱中，37°C 培养。每24h再冲气和换气一次后置37°C培养箱继续培养，分别在24h、48h、72h后收集各 组细胞，用于MTT实验。
[0034] 2、细胞增殖的检测
[0035] (1)收集对数生长期MiaPaCa-2细胞，制备成单细胞悬液进行计数，调整浓度以每 孔5 X IO3个细胞接种96孔细胞培养板中，每孔总体积100 μ L (边缘孔用同体积的无菌PBS 填充），于5% C02、37°C、饱和湿度的CO2培养箱中培养，待细胞形成单层后弃上清给予不同 浓度化合物（I )处理。
[0036] (2)分空白对照组（不加药物处理的等体积培养液）和化合物（I )药物 20 μ mol/L、40 μ mol/L、80 μ mol/L)，每组设6个平行孔，实验重复三次，置入37°C，5% C02、 94% N2、l% O2的缺氧小室中分别培养24h、48h、72h。
[0037] (3)用PBS轻轻冲洗96孔细胞培养板2次后，每孔加入10 μ L MTT (5mg/mL)，继续 培养4h后离心弃上清，每孔加入15 μ L的DMS0,放在摇床上振荡15min，使结晶物充分溶 解。
[0038] (4)酶联免疫检测仪于570nm处测量各孔的吸光度值（A值），计算细胞增殖抑制 率。
[0039] (5)抑制率（％) =(空白对照组平均A值-药物组平均A值）/空白对照组平均 A 值 X 100% 〇
[0040] (6)以浓度为横轴，抑制率（％)为纵轴绘制抑制率直方图。
[0041] 3、统计学方法
[0042] 采用SPSS 17. 0进行数据处理，计量资料计量资料符合正态分布的，以均数士标 准差（i±S)表示，均数间比较采用单因素方差分析或t检验，以P〈0. 05为差异有统计学意 义。
[0043] 三、结果及结论
[0044] MTT结果显示：（1)化合物（I )干预人胰腺癌MiaPaCa-2细胞同等时间（24h、 48h、72h)时，随着化合物（I )浓度（在实验浓度范围间内）的增加，其所对应的OD值越 小，表明在缺氧条件下化合物（I )对人胰腺癌MiaPaCa-2细胞干预时间相同时，随着药物 浓度的增加，细胞存活率降低。结果见表1 (注：aP〈〇. 01 VS对照组；bP〈0. 01 VS 20 μπιο?/ L 组；。Ρ〈0· 01 VS 40 μ mol/L 组）。
[0045] ⑵不同浓度的（2〇ymol/L、40ymol/L、8〇ymol/L)化合物（I )干预人胰腺 癌MiaPaCa-2细胞48h后，不同浓度作用下细胞增殖抑制率分别为（20. 13±0. 80) %、 (34. 83±0. 66) %、（45. 68±1. 45) %，抑制率随药物浓度增加呈上升趋势，组间差异有 统计学意义（P〈〇.〇5)。80ymol/L的化合物（I )干预胰腺癌MiaPaCa-2细胞24h、 48h、72h 后，MiaPaCa-2 细胞生长抑制率分别为（38. 78±0· 92) %、（45. 68±1· 45) %、 (55. 95±2. 20) %，呈时间依赖性增高，组间差异有统计学意义（Ρ〈0. 05)。结果见表2(注： $〈0.01￥5对照组；4〈0.01￥5 2(^111〇1/1组；。？〈0.01￥5 4(^111〇1/1组）。
[0046] 结论，化合物（I )对缺氧培养条件下人胰腺癌MiaPaCa-2细胞有明显的增殖抑 制作用，随着化合物（I )浓度的增加和作用时间的延长，抑制作用愈明显，即在一定浓度 范围内存在时间一一剂量依赖性。这可能成为胰腺癌治疗的另一新思路。
[0047] 表1化合物（I )对人胰腺癌MiaPaCa-2细胞生长的影响（η = 6, i±s )
[0048]
[0049] 表2化合物（I )对人胰腺癌MiaPaCa-2细胞生长抑制率的影响（η = 6, [士s )
[0052] 实施例3
[0053] 片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有机酸如酒石酸、或 柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为 1:9的比例加入赋形剂，制粒压片。
[0054] 实施例4
[0055] 口服液制备：按实施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有机酸如酒石酸、或 柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成 口服液。
[0056] 实施例5
[0057] 胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有机酸如 酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂 重量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
[0058] 实施例6
[0059] 注射液的制备：按实施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有机酸如酒石酸、 或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精 滤，灌封灭菌制成注射液。
[0060] 实施例7
[0061] 无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有机酸如酒石 酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射 用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌 熔封得粉针剂。
[0062] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 具有下述结构式的化合物（I)，2. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于包含W下操作步骤：(a)将 黄巧的干燥根粉碎，用75~85 %乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油 酸、乙酸乙醋和水饱和的正下醇萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃 取物；化）步骤（a)中乙酸乙醋萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱6个柱体积，再 用75 %乙醇洗脱8个柱体积，收集75 %乙醇洗脱液，减压浓缩得75 %乙醇洗脱物浸膏；（C) 步骤化）中75%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为90:1、65:1、30:1、15:1和 1:1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤（C)中组分4用正相硅胶进一步分 离，依次用体积比为25:1、15:1和5:1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤 (d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70%的甲醇水溶液 等度洗脱，收集8~10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物（I)。3. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂为AB-8 型大孔吸附树脂。4. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于：所述用乙醇热回流 提取义用的乙醇浓度为80 %。5. -种药物组合物，其特征在于：其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物 (I)和药学上可接受的载体。6. 权利要求1所述的化合物（I)在制备治疗膜腺癌药物中的应用。7. 权利要求5所述的药物组合物在制备治疗膜腺癌药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种新的甾体类化合物及其制备方法和医药用途。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的甾体类化合物，可以从黄芪的干燥根中提取、分离纯化得到。本研究证实该化合物对缺氧培养条件下人胰腺癌MiaPaCa-2细胞有明显的增殖抑制作用，随着该化合物浓度的增加和作用时间的延长，抑制作用愈明显，即在一定浓度范围内存在时间——剂量依赖性，可以用来开发成治疗胰腺癌的药物。
【IPC分类】A61K31/575, A61P35/00, C07J9/00
【公开号】CN105399792
【申请号】CN201510887403
【发明人】杨辉
【申请人】西宁意格知识产权咨询服务有限公司
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年12月7日