基，得到如SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列，命名为序列 BAP23-3,化学全合成序列BAP23-3 ;
[0069] ⑵·用限制性内切酶Nco I和EcoR I酶切pET30a(+)质粒和实施例5步骤⑴所 得序列BAP23-3,并用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切产物，将酶切后的核苷酸序列BAP23-3 和pET30a(+)质粒于16°C连接过夜，获得重组表达载体A3 ;
[0070] ⑶.设计一对引物特异性引物，以PPASE重组质粒为模版，PCR扩增其中的无机焦 磷酸酶的编码基因，其序列如SEQ ID NO :10所示，用PCR清洁试剂盒回收PCR产物；正向引 物的序列如SEQ ID NO :11所示，其酶切位点为EcoR I ;反向引物的序列如SEQ ID NO :12 所示，其酶切位点为Not I ;PCR程序为：95°C变性5min，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C 延伸lmin，34个循环，最后72°C延伸IOmin ;
[0071] ⑷.用限制性内切酶EcoR I和Not I酶切实施例5步骤⑶所得的纯化后的无机 焦磷酸酶编码基因和实施例5步骤⑵所得重组表达载体A3,将酶切后的无机焦磷酸酶编码 基因和重组表达载体A3于16°C连接过夜，获得重组表达载体B3 ;
[0072] (5).用实施例5步骤⑷所得重组表达载体B3转化E. coliBL21 (DE3)感受态细胞， 获得重组基因工程菌A3 ;
[0073] (6).挑取实施例5步骤(5)所得重组基因工程菌A3单菌落接种于5mL含有终浓度 为50 μ g/mL的卡那霉素的LB培养基中，37°C培养24h，获得种子液；将上述5mL种子液全 部接种于500mL含有终浓度为50 μ g/mL的卡那霉素的LB培养基中，37°C培养3小时后，加 入终浓度为0. 05mM的IPTG，30°C诱导培养16h，表达结果如图5所示。
[0074] 实施例6生物素化无机焦磷酸酶的纯化
[0075] 按照实施例5的方法表达的生物素化无机焦磷酸酶，利用组氨酸亲和层析柱进行 纯化。
[0076] 纯化方法同实施例2 ;采用超微量蛋白浓度测定仪测定纯化后的生物素化无机焦 磷酸酶的浓度，约为7. 2mg/mL。
[0077] 实施例7无机焦磷酸酶的固定化
[0078] 固定化方法：
[0079] 取10 μ L链亲合素包被的磁珠混悬液Dynabeads M_280Streptavidin静置于磁 铁上 Imin 后，弃去上清液；用 50 μ L 洗涤缓冲液（0.1 M Tris-HCl (pH7. 9) +0. 5mM EDTA+5mM MgAc2+0. 4g/LPVP+0. 02% (W/v)BSA+lmM DTT)洗涤两次后，用40 μ L洗涤缓冲液重悬磁珠； 加入10 μ L纯化后的生物素化无机焦磷酸酶，混匀，4°C放置Ih后；置于磁铁上，待磁珠完全 集中后弃去上清液，用洗涤缓冲液洗涤Bead-PPase两次，最后将Bead-PPase重悬于10 μ L 洗涤缓冲液中。
[0080] 实施例8无机焦磷酸酶的活力测定
[0081] 显色剂配制：将13g钼酸铵溶解于IOOmL去离子水中，得到溶液A ;将0. 35g酒石 酸锑氧钾溶解于IOOmL去离子水中，得到溶液B ;将溶液A、溶液B和硫酸溶液按3:3:1的体 积比混合均匀，得到显色剂。
[0082] 测活标准曲线的绘制：配制不同浓度的磷酸根离子（P043 )标准溶液：0mM、 0. 008mM、0. 012mM、0. 016Mm、0. 024mM、0. 032mM ;分别向上述标准溶液中加入终浓度为 0. 2% (w/v)的抗坏血酸，反应30s;加入4% (v/v)的显色剂混合均勾后，放置15min;于 700nm下测定吸光度A7。。。以吸光度A7。。对磷酸根离子浓度作图，绘制测活标准曲线，如图6 所示。
[0083] 无机焦磷酸酶的活力测定方法：将待测样品加入500 μ L测活反应液中（IOOmM pH8. 0的Tris-HCl+3mM MgCl2+100mM PPi)反应15min;以柠檬酸终止反应后，加入终浓度 为0. 2% (w/v)的抗坏血酸，反应30s;加入4% (v/v)的显色剂混合均勾后，放置15min;于 700nm下测定吸光度，并通过标准曲线计算生成的磷酸根（P043 )的浓度。
[0084] 活力单位定义：在25°C下，Imin内，生成1 μ mol磷酸根（P043 )所需的酶量定义为 1个单位（Unit)。
[0085] 将按照实施例1的表达方法表达的生物素化无机焦磷酸酶编号为样品1 ;
[0086] 将样品1按照实施例7的固定化方法制得的Bead-PPase编号为样品2 ;
[0087] 将样品2用实施例7所述的洗涤缓冲液反复洗涤3、6、9和15次后的Bead-PPase 分别编号为样品3、4、5、6 ;
[0088] 将按照实施例3的表达方法表达的生物素化无机焦磷酸酶编号为样品7 ;
[0089] 将样品6按照实施例7的固定化方法制得的Bead-PPase编号为样品8 ;
[0090] 将样品7用实施例7所述的洗涤缓冲液反复洗涤3、6、9和15次后的Bead-PPase 分别编号为样品9、10、11、12。
[0091] 将按照实施例5的表达方法表达的生物素化无机焦磷酸酶编号为样品13 ;
[0092] 将样品13按照实施例7的固定化方法制得的Bead-PPase编号为样品14 ;
[0093] 将样品14用实施例7所述的洗涤缓冲液反复洗涤3、6、9和15次后的Bead-PPase 分别编号为样品15、16、17、18。
[0094] 利用上述测定方法分别活性测定方法样品1-18的相对活力，结果如下表：
[0095] 表1无机焦磷酸酶相对活力测定结果
[0097] 其中样品1、样品7和样品13的相对活力指每mg蛋白的催化活力；其余样品的相 对活力指每ULBead-PPase的催化活力。
【主权项】
1. 一种生物素化无机焦磷酸酶的表达方法，其特征在于：所述表达方法使用一种由23 个氨基酸残基组成的生物素受体蛋白BAP23,将该生物素受体蛋白的编码基因构建到大肠 杆菌表达载体中，获得一种携带上述生物素受体蛋白编码基因的重组表达载体，当无机焦 磷酸酶的编码基因构建到上述重组表达载体中后，能够表达该生物素受体蛋白和无机焦磷 酸酶的融合蛋白，该融合蛋白能够在大肠杆菌细胞内被生物素化修饰；其中，所述的生物素 受体蛋白BAP23的序列为SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。2. 如权利要求1所述的表达方法，其特征在于：所述表达方法包括以下步骤： ⑴.合成生物素受体蛋白BAP23的编码基因； ⑵.将步骤⑴合成的生物素受体蛋白BAP23的编码基因构建到大肠杆菌表达载体中， 获得重组表达载体A; ⑶.将无机焦磷酸酶的编码基因构建到步骤⑵所得的重组表达载体A中，获得重组表 达载体B; ⑷.用步骤⑶所得的重组表达载体B转化大肠杆菌宿主细胞，获得重组基因工程菌A; (5).以步骤⑷所得的重组基因工程菌A作为生产菌株，进行诱导表达培养。3. 如权利要求2所述的表达方法，其特征在于：所述的表达方法步骤⑴中所述的生物 素受体蛋白BAP23的编码基因为SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。4. 如权利要求2或3所述的表达方法，其特征在于：所述的表达方法步骤⑵中所述的 大肠杆菌表达载体为pMAL-p4E和pET30a(+)中的任意一种。5. 如权利要求4所述的表达方法，其特征在于：所述的表达方法步骤⑶中所述的大肠 杆菌表达载体为pMAL-p4E。6. 如权利要求4所述的表达方法，其特征在于：所述的表达方法步骤⑶中所述的大肠 杆菌表达载体为pET30a(+)。7. 如权利要求2或3所述的表达方法，其特征在于：所述的表达方法步骤⑶中所述的 重组表达载体B中的无机焦磷酸酶的编码基因构建于BAP23的编码基因的上游或下游。8. 如权利要求7所述的表达方法，其特征在于：所述的表达方法步骤⑶中所述的重组 表达载体B中：无机焦磷酸酶的编码基因构建于BAP23的编码基因的上游。9. 如权利要求7所述的表达方法，其特征在于：所述的表达方法步骤⑶中所述的重组 表达载体B中的无机焦磷酸酶的编码基因构建于BAP23的编码基因的下游。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生物素化无机焦磷酸酶的表达方法，其中：使用一种由23个氨基酸残基组成的生物素受体蛋白BAP23，将BAP23的编码基因构建到大肠杆菌表达载体中后，获得重组表达载体，当无机焦磷酸酶编码基因插入到上述重组表达载体中后，表达的融合蛋白能够在大肠杆菌细胞内被生物素化修饰。按照本发明提供的表达方法表达的生物素化无机焦磷酸酶的产量达到21～38mg/100mL培养基；比活力达到94.2～151.6U/mg。表达的生物素化无机焦磷酸酶被磁珠固定后得到的Bead-LUC被反复洗涤3次后，催化活力几乎不受影响；被反复洗涤15次后，仍能够维持相较于洗涤前91％以上的相对活力。
【IPC分类】C12N9/14, C12N15/70
【公开号】CN105400749
【申请号】CN201511024977
【发明人】高静, 蔡亦梅, 吴超, 徐潇, 张睿, 王者馥, 王绪敏, 殷金龙, 任鲁风
【申请人】北京中科紫鑫科技有限责任公司
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年12月30日