一种嗜酸乳杆菌及其应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一株具有高抗胃肠道胁迫的嗜酸乳杆菌（Lact〇baci1 1us acidophilus)，属于微生物技术领域。
【背景技术】
[0002] ExpertCommittee定义益生菌为"活的微生物，以一定数量摄入，能对健康产生益 处，并且这种益处超越一般的固有营养"，这表明：益生菌必须是活的，同时要以高数量存 在，通常日摄入剂量为1〇 9细胞量。益生菌的大部分菌株为乳杆菌属和双歧杆菌属，因这些 乳酸菌生产发酵乳制品有一段长的记录历史，所以一直被沿用。
[0003] 益生菌进入机体，需要耐受胃肠道酸性环境及胃肠道胆盐环境，所以如何耐受住 胃酸、肠酸及胆汁，成为益生菌发挥作用的前提。因此，筛选出具有高抗胃肠道胁迫的乳酸 菌是非常必要的。
[0004] 东北农业大学工学硕士学位论文"抗胃肠道胁迫益生菌的筛选及产品开发"（田芬 等)一文就抗胃肠道胁迫的益生菌进行了筛选，并且利用细菌生态学、生理学和基因序列分 析，筛选出性能较佳的5株益生菌作为研究对象，分别为嗜酸乳杆菌KLDSAD1和AD2，动物双 歧杆菌KLDS2.0001、2.0002和2.0604，继续后续的研究，并且得出嗜酸乳杆菌和动物双歧 杆菌都有很好的酸和胆汁盐耐受性，动物双歧杆菌的耐酸性较强于嗜酸乳杆菌的耐酸性。
[0005] 虽然研究得出的嗜酸乳杆菌KLDSAD1和AD2均具良好的胃酸耐受性，但是仍然不 能达到高酸条件下的具有很好的胃肠道胁迫能力，因此，在此基础上，申请人进行了进一步 的研究，进一步筛选更高的抗胃肠道胁迫能力的乳杆菌。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的之一是筛选出一种嗜酸乳杆菌CGMCC10436,其具有更高的胃肠道胁 迫能力。
[0007] 本发明的另一目的是公开这种嗜酸乳杆菌的应用。
[0008] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0009] -株嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)CGMCC10436,该菌株是从传统乳 制品中分离的乳酸菌中筛选出的，于2015年01月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心，微生物保藏号为CGMCCNo. 10436,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路 1号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0010] 具体的，所述的嗜酸乳杆菌来自于内蒙古锡林郭勒盟、海拉尔市及鄂尔多斯市等 地区的牧民家中采集传统方法制作的传统稀奶油或酸化奶油，用于乳酸菌的筛选。具体如 下：
[0011] (1)将25g样品在无菌条件下剪碎，溶于225mL无菌生理盐水中，梯度稀释后选择合 适的稀释度，取lmL稀释液加入无菌平皿，倾注于20mLMRS固体培养基上，30°C培养72h。
[0012] (2)选取菌落数量在15~150的平板，随机选取符合乳酸菌菌落形态特征的菌落， 从中挑取少量细菌，溶于于MRS液体培养基中，并进行30°C培养48h。
[0013](3)将分离到的菌株在MRS固体培养基上反复划线进行纯化。
[0014](4)将纯化好的菌株进行革兰氏染色及过氧化氢酶实验。
[0015](5)将所有革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、不形成芽孢的菌株(初步判断为乳酸菌） 选出来，在其培养液中加入甘油，使甘油的最终浓度为30% (v/v)，贮藏于_80°C待用。
[0016] (6)将上述分离到暂定为乳酸菌的菌株在MRS液体培养基中活化3代后进行筛选实 验。
[0017](7)以标准菌株嗜酸乳杆菌作为对照菌株，进行以下生理生化试验:H2S试验、甲基 红试验、石蕊牛乳试验、明胶液化试验、淀粉水解试验、柠檬酸盐利用试验、尿素分解试验、 硝酸盐降解试验及乙偶姻产生试验，选取与标准菌株嗜酸乳杆菌生理生化试验相同的乳酸 菌。
[0018](8)提取菌株基因组DNA，进行16SrDNA测序，将本发明菌株的16SrDNA序列与NCBI嗜酸乳杆菌的序列进行比对，鉴定出，此菌株为嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus)〇
[0019] 然后，将本发明嗜酸乳杆菌与嗜酸乳杆菌(嗜酸乳杆菌KLDSAD1、嗜酸乳杆菌酸乳 杆菌KLDSAD2)进行对比，研究此次筛选出的嗜酸乳杆菌的抗胃肠道胁迫能力。试验结果表 明，本研究筛选出的嗜酸乳杆菌对酸液、肠液及人工胆盐均具有较好的耐受力，并且效果明 显优于嗜酸乳杆菌KLDSAD1、酸乳杆菌KLDSAD2。
[0020] 所筛选出来的嗜酸乳杆菌具有高的抗胃肠道胁迫能力。
[0021] 并且所述的嗜酸乳杆菌能够制成发酵乳制品，这些发酵乳制品选自酸奶酪、乳清 乳酸菌饮料、干奶酪、含发酵酸奶的加工食品、含发酵酸奶的保健食品等。所述的加工食品 或保健食品的原料选自选自动物奶、奶酷蛋白、谷物、谷物蛋白质、小麦、小麦蛋白质、大?、 大豆乳、脱脂大豆、大豆蛋白质及其混合物等，并且并不限于此。具体嗜酸乳杆菌在乳制品 中的含量可以根据实际需要进行添加。
[0022] 进一步地，所述的发酵乳制品还包括双歧杆菌或其他一切对肠道有好处的益生 菌。
[0023]所述的嗜酸乳杆菌还能够制成具有高抗胃肠道胁迫功能的活菌制剂，制剂包括胶 囊、片剂、口服液、粉剂等一切临床上可以接受的制剂形式。
[0024]本发明的有益效果：
[0025]本发明通过耐酸、耐胆盐及抑菌试验等筛选出一株具有高抗胃肠道胁迫活性的嗜 酸乳杆菌，并且其可以有效的制成乳制品或药物制剂并且保持活性，广泛用于食品工业、药 物等领域。
[0026]本发明筛选出的嗜酸乳杆菌具有较高的抗胃肠道胁迫的能力，为进一步研究嗜酸 乳杆菌的抗胃肠道胁迫机理奠定理论基础。
【附图说明】
[0027]图1为本发明嗜酸乳杆菌以16SrDNA全序列为基础的系统发育树。
[0028]图2为本发明嗜酸乳杆菌对人工胃液的耐受力；
[0029]图3为嗜酸乳杆菌KLDSAD1对人工胃液的耐受力；
[0030]图4为嗜酸乳杆菌KLDSAD2对人工胃液的耐受力；
[0031]图5为三株乳酸杆菌对人工肠液的耐受力；
[0032]图6为嗜酸乳杆菌KLDSAD1的耐胆盐能力；
[0033]图7为嗜酸乳杆菌KLDSAD2的耐胆盐能力；
[0034]图8为本发明嗜酸乳杆菌的耐胆盐能力；
【具体实施方式】
[0035]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应 该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修 改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0036] -、材料与试剂
[0037] 菌株:嗜酸乳杆菌KLDSAD1和嗜酸乳杆菌KLDSAD2均分离自内蒙古传统稀奶油或 酸化奶油，由乳品科学教育部重点实验室菌种保藏中心(KLDS-DICC)保藏，菌种使用前用 MRS培养基活化以上菌株，以2 %接种量在37°C下培养14h，以备实验使用；
[0038]培养基:MRS培养基。
[0039]MRS培养基配制：蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖 20g/L，无水乙酸钠5g/L，柠檬酸氢二胺2g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰 0 · 25g/L，吐温-80lml/L，pH6 · 3 ± 0 · 1，121°C、15分钟灭菌；
[0040]主要试剂:磷酸氢二钾:天津光复科技发展有限公司；硫酸锰:天津东丽区天大化 学仪器厂;柠檬酸氢二胺:天津东丽区天大化学仪器厂。
[0041 ] 主要仪器：JY92-2D超声破碎粉碎机：SCIENTZ公司；厌氧箱FormaAnaerobic systeml029:THERM0ELECTRONCORPORATION公司；DU800型紫外分光光度计：BECKMAN C0ULTER;GL-21M型低温冷冻离心机:上海市离心机械研究所。
[0042]二、嗜酸乳杆菌菌株的筛选
[0043]从内蒙古锡林郭勒盟、海拉尔市及鄂尔多斯市等地区的牧民家中采集传统方法制 作的传统稀奶油或酸化奶油，用于乳酸菌的筛选。具体如下：
[0044] (1)将25g样品在无菌条件下剪碎，溶于225mL无菌生理盐水中，梯度稀释后选择合 适的稀释度，取lmL稀释液加入无菌平皿，倾注于20mLMRS固体培养基上，30°C培养72h。
[0045] (2)选取菌落数量在15~150的平板，随机选取符合乳酸菌菌落形态特征的菌落， 从中挑取少量细菌，溶于于MRS液体培养基中，并进行30°C培养48h。
[0046] (3)将分离到的菌株在MRS固体培养基上反复划线进行纯化。
[0047] (4)将纯化好的菌株均进行革兰氏染色及过氧化氢酶实验。
[0048] (5)将所有革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、不形成芽孢的菌株(初步判断为乳酸菌） 选出来，在其培养液中加入甘油，使甘油的最终浓度为30% (v/v)，贮藏于_80°C待用。
[0049] (6)将上述分离到暂定为乳酸菌的菌株在MRS液体培养基中活化3代后进行鉴定实 验。
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