述发根农杆菌A4的载体上含有35S:RFP基 因；所述RFP基因用SEQ.ID.NO1所示；
[0053] (3)侵染外植体、共培养:将活化发根农杆菌A4涂抹在划口后的新疆枸杞无菌叶片 的伤口处，放在共培养基上，在24°C，光照16h、暗培养8h，培养4d;
[0054] (4)发根培养:将步骤(3)获得的新疆枸杞叶片更换到发根培养基上，封口膜封好， 24°C，光照16h，暗培养8h，培养25d，每6天更换一次发根培养基；
[0055](5)荧光检测;检测步骤(4)获得的毛状根中的RFP基因的红色荧光的存在与否;具 有红色荧光的毛状根即为转基因新疆枸杞毛状根。其转基因新疆枸杞毛状根的形状与实施 例1的转基因河北枸杞毛状根的形状相似。
[0056]含抗生素的LB固体培养基是用下述方法制成:在LB固体培养基配方中加入卡那霉 素，使卡那霉素的终浓度为80mg/L，加入壮观霉素，使壮观霉素的终浓度为80mg/L。
[0057] 含抗生素的LB液体培养基是用下述方法制成:在LB液体培养基配方中加入卡那霉 素，使卡那霉素的终浓度为80mg/L，加入壮观霉素，使壮观霉素的终浓度为80mg/L。
[0058] 实施例3
[0059] -种转基因宁夏枸杞毛状根的基因转化方法，包括以下步骤：
[0060] (1)制备宁夏枸杞无菌叶片:将宁夏枸杞叶片，清水冲洗干净后用无水乙醇擦拭表 面，用体积浓度为75 %的乙醇水溶液消毒灭菌5min，灭菌蒸馏水漂洗5次，接种于MS培养基 上，25°C暗共培养获得宁夏枸杞无菌叶片；
[0061] (2)发根农杆菌A4活化:将发根农杆菌A4在含抗生素的LB固体培养基上划线，28°C暗处倒置培养48h后获得单菌落，挑取单菌落于含抗生素的LB液体培养基上，28°C、摇床转 速220rpm暗培养36h，得到活化发根农杆菌A4;所述发根农杆菌A4的载体上含有35S:RFP基 因；所述RFP基因用SEQ.ID.NO1所示；
[0062] (3)侵染外植体、共培养:将活化发根农杆菌A4涂抹在划口后的宁夏枸杞无菌叶片 的伤口处，放在共培养基上，在25°C，光照16h、暗培养8h，培养6d;
[0063](4)发根培养:将步骤(3)获得的枸杞叶片更换到发根培养基上，封口膜封好，25 °C，光照16h，暗培养8h，培养30d，每8天更换一次发根培养基；
[0064](5)荧光检测;检测步骤(4)获得的毛状根中的RFP基因的红色荧光的存在与否;具 有红色荧光的毛状根即为转基因宁夏枸杞毛状根。其转基因宁夏枸杞毛状根的形状与实施 例1的转基因河北枸杞毛状根的形状相似。
[0065] 含抗生素的LB固体培养基是用下述方法制成:在LB固体培养基配方中加入卡那霉 素，使卡那霉素的终浓度为120mg/L，加入壮观霉素，使壮观霉素的终浓度为120mg/L。
[0066]含抗生素的LB液体培养基是用下述方法制成:在LB液体培养基配方中加入卡那霉 素，使卡那霉素的终浓度为120mg/L，加入壮观霉素，使壮观霉素的终浓度为120mg/L。
[0067] 实施例4
[0068]转基因枸杞毛状根的液体培养方法，包括如下步骤：
[0069] (1)配制含植物激素的液体培养基：向1/2MS液体培养基中加入植物激素IBA使浓 度为0 · 3mg/L，混合均勾；
[0070] (2)将实施例1获得的转基因枸杞毛状根在步骤（1)获得的含植物激素的液体培养 基中，26°C，转速lOOrpm，培养；18天更换一次步骤（1)获得的含植物激素的液体培养基，对 转基因枸杞毛状根进行扩大培养。（见图3)。
[0071] 实施例5
[0072]转基因枸杞毛状根的液体培养方法，包括如下步骤：
[0073] (1)配制含植物激素的液体培养基：向1/2MS液体培养基中加入植物激素IBA使浓 度为0.lmg/L，混合均勾；
[0074](2)将实施例2获得的转基因枸杞毛状根在步骤（1)获得的含植物激素的液体培养 基中，24°C，转速80rpm，培养;15天更换一次步骤(1)获得的含植物激素的液体培养基，对转 基因枸杞毛状根进行扩大培养。结果与实施例4相似。
[0075] 实施例6
[0076] 转基因枸杞毛状根的液体培养方法，包括如下步骤：
[0077] (1)配制含植物激素的液体培养基：向1/2MS液体培养基中加入植物激素IBA使浓 度为0 · 5mg/L，混合均勾；
[0078] (2)将实施例3获得的转基因枸杞毛状根在步骤（1)获得的含植物激素的液体培养 基中，28°C，转速120rpm，培养;20天更换一次步骤（1)获得的含植物激素的液体培养基，对 转基因枸杞毛状根进行扩大培养。结果与实施例4相似。
[0079]本发明的方法，利用含35S:RFP报告基因的发根农杆菌A4侵染枸杞无菌苗的叶片， 获得共转化植株，进而得到转化毛状根。采用本发明的方法不仅可以大大缩短转化周期，也 可以直观的看到实验结果；以枸杞离体毛状根体系进行根系发育方面的研究可以人为控制 培养条件，消除环境因素带来的影响;此外，该方法结合液体扩繁培养可以克服枸杞实生苗 根系因土壤环境给观察、取样带来的困难，从而有望改变枸杞根系研究相对落后的现状。本 发明为枸杞基因功能验证提供了一种快速可靠的方法，也为枸杞基因的遗传改良提供一种 新的转化方法。
【主权项】
1. 一种转基因枸杞毛状根的基因转化方法，其特征是包括以下步骤： (1) 制备枸杞无菌叶片:将枸杞叶片，清水冲洗干净后用无水乙醇擦拭表面，用乙醇水 溶液消毒灭菌5-10min，灭菌蒸馏水漂洗3-5次，接种于MS培养基上，25°C暗共培养获得枸杞 无菌叶片； (2) 发根农杆菌A4活化:将发根农杆菌A4在含抗生素的LB固体培养基上划线，28°C暗处 倒置培养36-48h后获得单菌落，挑取单菌落于含抗生素的LB液体培养基上，28°C、摇床转速 180-220rpm暗培养36-48h，得到活化发根农杆菌A4;所述发根农杆菌A4的载体上含有35S: RFP基因；所述RFP基因用SEQ.ID.NO1所示； (3) 侵染外植体、共培养:将活化发根农杆菌A4涂抹在划口后的枸杞无菌叶片的伤口 处，放在共培养基上，在24°C~25°C，光照16h、暗培养8h，培养4-6d; (4) 发根培养:将步骤(3)获得的枸杞叶片更换到发根培养基上，封口膜封好，24°C~25 °C，光照16h，暗培养8h，培养25-30d，每6-8天更换一次发根培养基； (5) 荧光检测;检测步骤(4)获得的毛状根中的RFP基因的红色荧光的存在与否;具有红 色荧光的毛状根即为转基因枸杞毛状根。2. 权利要求1的方法获得的转基因枸杞毛状根。3. 权利要求2的转基因枸杞毛状根的液体培养方法，其特征是包括如下步骤： (1) 配制含植物激素的液体培养基：向1/2MS液体培养基中加入植物激素IBA使浓度为 0 · 1-0 · 5mg/L，混合均勾； (2) 将转基因枸杞毛状根在步骤(1)获得的含植物激素的液体培养基中，24-28°C，转速 80-120rpm，培养；15-20天更换一次步骤（1)获得的含植物激素的液体培养基，对转基因枸 杞毛状根进行扩大培养。4. 根据权利要求1所述的一种转基因枸杞毛状根的基因转化方法，其特征是所述含抗 生素的LB固体培养基是用下述方法制成:在LB固体培养基配方中加入卡那霉素，使卡那霉 素的终浓度为80-120mg/L，加入壮观霉素，使壮观霉素的终浓度为80-120mg/L。5. 根据权利要求1所述的一种转基因枸杞毛状根的基因转化方法，其特征是所述含抗 生素的LB液体培养基是用下述方法制成:在LB液体培养基配方中加入卡那霉素，使卡那霉 素的终浓度为80-120mg/L，加入壮观霉素，使壮观霉素的终浓度为80-120mg/L。
【专利摘要】本发明公开了一种转基因枸杞毛状根、基因转化方法及液体培养方法，转基因枸杞毛状根的基因转化方法，包括以下步骤：(1)制备枸杞无菌叶片；(2)发根农杆菌A4活化；(3)侵染外植体、共培养；(4)发根培养；(5)荧光检测；检测步骤(4)获得的毛状根中的RFP基因的红色荧光的存在与否；具有红色荧光的毛状根即为转基因枸杞毛状根。本发明通过发根农杆菌介导的转基因技术，可在短时间内得到毛状根，节约研究时间，并且转化效率较高，可达60％～70％左右。在液体培养基中枸杞毛状根可以大量的繁殖生长，解决了取材的问题，且易于观察生长情况。
【IPC分类】C12N15/82, A01H5/06
【公开号】CN105420271
【申请号】CN201510860926
【发明人】金超, 朱雪瑞, 孔彦, 季静
【申请人】天津大学
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年11月30日