无特殊说明均为常规市售试 剂或按常规方法配制的试剂。
[0015]实施例1: PnbHLHl基因的克隆以及生物信息学分析 采用改良的异硫氰酸胍法提取经茉莉酸甲酯处理3-6 h的三七细胞总RNA(图1)，并参 照NucleoTeap? mRNA (MACHERGY-NAGEL)试剂盒进行mRNA的分离（图2);取1 yg mRNA按照 Matchmaker? Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System构建cDNA文库，并利用 Trimmer-2 cDNA normalization kit试剂盒进行文库的均一化。
[0016] 设计添加了酶切位点Xho I和Hindm的诱饵序列3个重复的JERE序列，通过退 火将该序列合成为双链。用Xho I和Hind St对pAbAi载体和JERE诱饵序列进行双酶切，胶回 收目的片段，将回收的JERE诱饵片段与线性pAbAi载体片段4°C过夜进行连接，然后转化入 大肠杆菌感受态中，挑选单克隆进行菌液PCR检测并对阳性单克隆进行测序；引物根据插入 片段进行设计，上游引物为：5 ' -GTTCCTTATATGTAGCTTTCGACAT-3 '，下游引物为：5 ' - CTCCTTTCAAAGAAGGCGGTC-3'。将成功连接的pJERE-AbAi重组质粒利用同源法导入到 YIHgold酵母感受态细胞中，再将均一化后的三七细胞cDNA转入该酵母感受态细胞中，将转 化细胞涂布到含AbA抗性的SD/-Leu酵母培养基上，30°C培养3-5天。待酵母长出后，进行酵 母菌落PCR验证(图3)，挑选插入片段大于500bp的克隆进行测序。
[0017] 由测序结果知，本实验经酵母单杂交筛选获得了与茉莉酸甲酯诱导相关的bHLH类 转录因子基因。通过使用cDNA末端快速扩增技术(3'RACE)得到了PnbHLHl基因的3'片段，其 引物为5 ' -GCACTCTCTTCTCTAGTCCCTGGCC-3 '。再根据PnbHLHl基因的5 '和3 '末端序列设计引 物，用于扩增 PnbHLHl 基因的 cDNA 全长， 3 ' ； PnbHLHk: 5 ' -GGGAAAAGTTATTTCAT TAACACTGC-3 ' JCR反应条件：94 °C，5 min; 94°C，30 s;53°C，30 s;72°C，90 s，32个循环;72°C，10 min。将PCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶分离（图 4)、胶回收并连接到pGEM T-easy载体上，转化大肠杆菌感受态，挑单克隆摇菌，菌液PCR检 测后送测序。
[0018] 最终获得的PnbHLHl全长cDNA大小为 1430 bp，通过NCBI ORF finder (http:// www.ncbi .nlm. nih · gov/gorf/gorf .html)分析发现其包含一个966 bp的0RF(见序列表）。 PnbHLHl编码蛋白的分子量约为36.2 KD，等电点为7.60，不稳定系数为41.40，预测PnbHLHl 编码的蛋白质不稳定。生物信息学预测PnbHLHl不包含跨膜区，不含信号肽，具有一个bHLH 转录因子特征保守结构域。通过在线工具iPSORT预测PnbHLHl可能定位于细胞核。借助 SWISS-MODEL对PnbHLHl进行三维结构预测分析（图5)，结果表明，与长春花CrMYCl转录因子 的空间结构相比，两者主要的bHLH结构域较为形似，这进一步说明PnbHLHl属于bHLH类转录 因子。
[0019] 实施例2:植物表达载体构建 根据PnbHLHl基因0RF框的5 '和3 '末端序列设计引物，用于扩增PnbHLHl基因的0RF，分 别为上游引物：5 ' -TCTAGAATGGAGGATCCTTATTCCAATATCC-3 ' ；下游引物：5 ' -CTGCAGTCACATTAACTGTTTGAGAGCTGCG-S'JCR反应条件：94°C，5 min;94 °C，30 s;56°C，30 s ; 72°C，1 min，32个循环;72°C，10 min。将PCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶分离、胶回收并连 接到pGEM T-easy载体上，转化大肠杆菌感受态，挑单克隆摇菌，菌液PCR检测后送测序。
[0020] 采用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(上海生工）提取经测序正确的大肠杆 菌质粒pGEM-T-PnbHLHl以及植物表达载体pCAMBIA2300S的质粒，取1 yL用于琼脂糖凝胶电 泳以检测所提取质粒的完整性和浓度高低。用Xba I (TaKaRa)和Pst I (TaKaRa)分别对质 粒pGEM-T-PnbHLHl和pCAMBIA2300S进行双酶切（100 yL体系），反应体系和操作过程为：取 20 yL pGEM-T-PnbHLHl或pCAMBIA2300S质粒，依次加入 10 yL 10XM buffer、5 yL Xba I、 5 yL Pst I、60 yL ddH20,混匀后短时离心，置于37°C过夜反应。将所有酶切产物点于琼脂 糖凝胶中进行电泳，然后对PnbHLHl片段和pCAMBIA2300S大片段分别进行胶回收，整个过程 使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工）。取1 yL回收产物通过琼脂糖凝胶电泳检测 回收片段的大小以及浓度，置于-20 °C保存备用。
[0021 ]利用T4 DNA Ligase (TaKaRa)，将回收的PnbHLHl DNA片段和pCAMBIA2300S载体 片段连接起来，反应体系（20 μυ和操作过程为:取10 yL PnbHLHl DNA片段依次加入2 yL PCAMBIA2300S载体DNA、2 yL 10 XT4 DNA Ligase Buffer、1 yL T4 DNA Ligase、5 yL ddH20,混匀后短时离心，置于16°C水浴过夜反应。接着采用热激转化法将连接产物转入大 肠杆菌Trans 1-T1中，用含有50 mg/L卡那霉素(kanamycin，Km)的固体培养基筛选阳性克 隆。挑选单菌落摇菌，以菌液为模板用扩增PnbHLHl的特异性引物进行PCR，挑选出PnbHLHl 与PCAMBIA2300S成功连接的克隆，所检测的菌株若为阳性，加入20%甘油混匀后置于-80°C 保存备用。
[0022] 用试剂盒提取并纯化上述大肠杆菌中的pCAMBIA2300S-PnbHLHl质粒。制备农杆菌 EHA105菌株的感受态细胞并分装于1.5 mL离心管中，每管150 yL，液氮速冻后置于-80°C保 存备用。采用液氮冻融法将上述构建的植物表达载体pCAMBIA2300S-PnbHLHl转入所制备的 农杆菌EHA105感受态细胞中。操作步骤为：取3 yg pCAMBIA2300S-PnbHLHl质粒加入含有 150 yL感受态细胞的离心管中，轻轻混匀后冰浴30 min，接着转入液氮中速冻5 min，然后 迅速置于37°C水浴5 min，之后立即冰浴2 min，加入600 yL LB液体培养基，28°C振荡培养4 h。将活化后的农杆菌涂于含有50 mg/L Km的LB固体培养基上，28°C静置培养。挑选单菌落 摇菌，用扩增PnbHLHl的特异引物进行PCR，检测pCAMBIA2300S-PnbHLHl是否转入农杆菌中。 对于阳性克隆，加入甘油后置于_80°C保存备用。
[0023]实施例3:农杆菌介导的三七遗传转化 从-80°C冰箱中取出保存的含有pCAMBIA2300S-PnbHLHl质粒的农杆菌EHA105菌种，接 种于5 mL含有50 mg/L Km和25 mg/L利福平的LB液体培养基中，28°C培养至浑浊。吸取1 mL 浑浊的菌液至含有50 mg/L Km的LB固体培养基上，28°C培养48 h。将LB固体培养基上的农 杆菌刮下适量接种于MGL液体培养基中，附加40 mg/1的乙酰丁香酮，28°C振荡培养至OD600 为0.6时停止摇菌，所得菌液用于侵染。
[0024]将生长状态较好的三七愈伤组织接种到MS预培养基(含35 mg/L乙酰丁香酮)上进 行预培养3天。预培养完成后，将愈伤组织完全浸泡于上述农杆菌菌液中进行振荡培养。浸 染完毕，除去菌液，用无菌的滤纸吸取愈伤组织表面的菌液，再将愈伤组织接种到MS共培养 基(含35 mg/L乙酰丁香酮)上进行共培养3天。共培养完成后，用无菌水对愈伤组织进行洗 涤，再转接于含400 mg/L头孢霉素的MS培养基上进行除菌培养，于25°C暗培养15天，防止农 杆菌过度生长。最后将愈伤组织转接到筛选培养基中，每45天继代一次。经过5次筛选，最终 分离出具有Km抗性的增值速度快的纯的细胞系，用于后续检测。
[0025] 实施例4: PnbHLHl基因超表达对三七皂苷合成途径关键酶基因 FPS、HMGR和DS表 达 量的影响 选取25天左右、生长状态良好的三七转基因细胞系和野生型细胞系，分别提取RNA，然 后按照GoTaq? 2-Step