RT-qPCR System试剂盒说明书合成cDNA，反应体系和操作过程为： 在离心管中加入4 yg 总RNA和 1 yL 01igo(dT)i5,用Nuclease-free Water补齐至 10 yL，将 反应体系放于70°C变性5 min，然后置于冰上5 min。随后将离心管在离心机中短暂离心，使 反应液收集于管底，再向其中加入4 yL GoScript? 5XReaction Buffer、2 yL MgCl2 (25 mM)、l yL PCR Nucleotide Mix(10 mM)、0.5 yL Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor和1 yL GoScript? Reverse Transcriptase，将整个反应体系游祸混勾，离心收 集到管底，将反应物置于42°C恒温水浴锅中反应1 h，再于70°C水浴中维持15 min以终止反 应，最后将合成的cDNA置于-20°C冰箱中保存备用。
[0026] 以该cDNA为模板，根据三七GAPDH基因（登录号:KF815711.1)、法尼基焦磷酸合成 酶（Farnesyl diphosphate synthase, FPS)基因（登录号：DQ059550.1)、3_羟基-3-甲基戊 二酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl_CoA reducetase , HMGR)基因（登录号： KJ578757. 1)以及达玛稀二醇合酶（Dammarenediol-I I synthase)基因（登录号： KC953035.1)设计引物，依据GoTaq? 2-Step RT-qPCR System试剂盒说明书进行荧光半定 量PCR扩增三七内参基因和皂苷合成途径关键酶基因。所用引物序列为6六？0办：5'_ CTACCAACTGTCTTGCT CCCCT-3 '，GAPDHr:5 '-TGATGCAGCTCTTCCACCTCTC-3 '；FPSf : 5 '-CGGATGCTGGACT ATAATGTG-3 '，FPSr : 5 ' -ATTTACGGCAATCATACCAACC-3 ' ； HMGRf : 5 ' -GGCAGGACC CAGCACAAAATA-3'，HMGRr:5'-ACACCCAGAAGGTTCAAGCAA-3' ；DSf:5'-TATGAGTGGGAAGGGTGC-3 '，DSr: 5 ' -TGGCGATAATTGCTTGAGTA-3 '。具体反应体系和操作过程为:在PCR管中加入20 ng cDNA、25 yL GoTaq? qPCR Master Mix (2X)和0.2 yL qPCR Primers(GAPDHF/ GAPDHr, FPSf / FPSr, HMGRf / HMGRr, DSf / DSr, 10 mM)，用Nuclease-Free Water补齐至50 μΜ 将反应体系漩涡混匀后，离心将其收集到管底，随后将其置于荧光定量PCR仪中进行反应， 采用两步法进行荧光定量PCR，反应参数如下：热启动95 °C2 min;变性95 °C15 s，退火/ 延伸60 °C1 min，共45个循环。每个样品对应的每个基因重复检测2次。
[0027] qRT-PCR结果显示，转PnbHLHl基因三七细胞中FPS、HMGR和DS基因的表达量都比野 生型的高（图6 )，说明PnbHLHl作为转录因子，能够促进三七皂苷合成代谢途径中关键酶基 因 FPS、HMGR和DS的表达。图中，C表示对照组野生型细胞系，1、2和3分别表示不同的转基因 细胞系实验组。
[0028] 实施例5: PnbHLHl基因超表达对三七总皂苷合成量的影响 选取生长35天左右的转基因细胞系和野生型细胞系，分别置于洗净的100 mL三角瓶 中，加入20 mL的甲醇溶液浸泡过夜后，常温超声波处理1 h。过滤，收集滤液，将滤液挥干后 再用甲醇溶解，定容至25 mL，得粗提液。将残渣在50°C下烘至恒重，称重。精密吸取粗提液5 mL，置50 mL烧杯中水浴蒸干。蒸干后用4倍体积的蒸馏水分次溶解，充分溶解后过滤，滤液 全部转移至已处理好的HsplOO大孔树脂柱内，先用2个柱体积的蒸馏水慢慢洗去糖类等杂 质。Molish反应检测糖类杂质是否去除干净，如果结果呈阳性，继续用蒸馏水洗至阴性，然 后用75%乙醇溶液洗脱2个柱体积，收集醇液，水浴蒸干，残渣用甲醇溶液溶解，定容至25 mL〇
[0029] 精确吸取此样品150 yL至带塞的10 mL试管中（设3个重复），挥干溶剂，加入新配 制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，混匀后60°C水浴加热15 min，立即用冰 水冷却，加入5 mL冰醋酸，混匀静止10 min后554 nm测吸光度，参照标准曲线计算PNS含量。 结果显示，转PnbHLHl基因三七细胞中总皂苷含量高于野生型细胞中总皂苷含量（图7)，结 合qRT-PCR结果，表明PnbHLHl转录因子参与了三七皂苷的合成代谢调控，有助于皂苷产量 的提高。图中，C表示对照组野生型细胞系，1、2和3分别表示不同的转基因细胞系实验组。
[0030] 实施例6:PnbHLHl基因超表达对三七单体皂苷合成量的影响 利用HPLC法测定三七细胞系中部分重要单体皂苷(此1、1^1、1^1、1?(1、此和？1)的含量。 高效液相色谱条件为:高效液相色谱仪(戴安ULTIMATE 30R00 LPG-3400A四元梯度栗，WPS-3000SL自动进样器，PDA-3000二极管阵列检测器，TCC-3000柱温箱），Waters symmertry C18色谱柱(4.6X250mm, 5 μπι)，采用乙腈(A):水(B)为流动相进行线性梯度洗脱(v/v)，检 测柱温30°C，检测波长为203 nm，流速设定为1.0 mL/min。
[0031 ] 精确称取适量的单体皂苷此1、1^1、1^1、1?(1、1^和？1标准品，加入11^甲醇溶液，制 成浓度分别为340，300，260，320，280，300 ug/mL的标准品混合溶液。分别吸取4，6，8，10， 15，20，25，30 uL的混合标准品溶液注入高效液相色谱仪，根据上述色谱条件进行测定。以 进样量(yg)为横坐标(X)，色谱峰的面积为纵坐标(y)，绘制得出各单体皂苷的线性回归方 程。
[0032]分别称取0.1 g非转基因和总皂苷含量得到提高的转基因三七细胞粉末于干净的 50 mL三角瓶中，各自加入10 mL 70%甲醇溶液，过夜浸泡后用超声破碎仪处理90 min(60 w，4 s/5 s)。超声结束后，去滤渣留滤液，将滤液放置在50°C烘箱中过夜烘干。加10 mL蒸馏 水溶解烘干后的残余物，之后用相同体积的水饱合正丁醇（勿使用未水饱合过的正丁醇)萃 取2-3次，将最终收集到的萃取液放置在50°C烘箱中过夜烘干。用适量100%甲醇溶解烘干后 的残余物，之后将溶液定容至5 mL，混合均匀后经0.45 μπι滤膜过滤，利用高效液相色谱测 定皂苷溶液中部分重要单体皂苷的含量。结果显示，非转基因与转基因三七细胞系均检测 到了此1、1^1、他1、1?(1、此和？1这六种单体皂苷，转基因细胞系与非转基因细胞系相比，这六 种单体皂苷均出现不同幅度增长（图8)。目前普遍认为，T-DNA插入到宿主基因组上的位点 具有随机性，但本实验结果证明这种随机性当中可能蕴含着某种定向（趋向）性。图中，C表 示对照组野生型细胞系，1、2和3分别表示不同的转基因细胞系实验组。
【主权项】
1. 一种三七转录因子基因PnbHLHl，其特征在于:其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示。2. 权利要求1所述的三七转录因子基因PnbHLHl在提高三七皂苷合成代谢途径中关键 酶基因表达量和增加三七愈伤组织中总皂苷与单体皂苷含量的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种三七转录因子基因<i>PnbHLH1</i>及其用途，即在提高三七皂苷生物合成关键酶基因表达量和增加三七愈伤组织中总皂苷与单体皂苷含量的应用，<i>PnbHLH1</i>基因核苷酸序列如SEQ？ID？NO︰1？所示，编码bHLH类转录因子；本发明采用功能基因组学和代谢工程相关技术证明三七PnbHLH1转录因子具有正调控三七皂苷生物合成的功能；将本发明所述的三七<i>PnbHLH1</i>转录因子基因构建到植物表达载体上并转入三七愈伤组织中使其过量表达，增强了三七皂苷合成途径关键酶基因的表达量，提高了三七总皂苷与单体皂苷的产量。
【IPC分类】C12N15/82, C12N15/29
【公开号】CN105441463
【申请号】CN201610001936
【发明人】葛锋, 黄壮嘉, 刘迪秋
【申请人】昆明理工大学
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2016年1月6日